Глоссарий:
- Поляризованный свет - это световые волны, колебания которых распространяются в одном направлении.
- Световая волна - это электрическое и магнитное излучение с плоскостью колебания перпендикулярной плоскости распространения волны.
- Поляризатор (николь I) - это устройство, пропускающее через себя только полностью или частично поляризованный свет. Предназначен для пропускания поляризованного света на(через) исследуемый прозрачный объект и отсекание(рассеивание) неполяризованного (естественного света, искусственного света, в т.ч. излучения осветителя микроскопа). Интенсивность света прошедшего через поляризатор падает пропорционально квадрату косинуса угла между плоскостями поляризации поляризатора и анализатора (закон Малюса):
Где: I - интенсивность до прохождения через поляризатор, I - интенсивность света после прохождения поляризатора, φ - угол между плоскостями поляризации поляризованного света и поляризатора.
- Анализатор (николь II) - устройство, аналогичное поляризатору, но предназначенное для анализа поляризованного света.
Поворот анализатора относительно поляризатора на угол ϕ. Интенсивность света показана красной стрелкой.
- Компенсатор - это устройство для определения количественных характеристик поляризации. Преобразует контрастное видимое изображение в цветное, так как гасит определённые длины волн в белом свете.
- Линейно поляризованный свет - это свет с плоскостью колебания, ограниченной в одном направлении, и распространяющийся в одной плоскости.
- Фаза колебаний световой волны, с математической точки зрения, это аргумент функции световой волны, то есть ωt+φ 0 в функции sin(ωt+φ 0). С физической, это определённое электромагнитное состояние в определённый момент времени.
- Длина волны – расстояние между двумя ближайшими точками, находящимися в одной фазе.
- Отражение - это изменение направления волны. Полным отражением называют изменение угла преломления волны менее 90°.
- Преломление - это изменение направления волны на границе двух сред. Двойное лучепреломление – это расщепление одного луча света в анизотропной среде на две луча.
Рисунок 4 – Преломление лучей в кристалле исландского шпата.
- Дихроизм - это частичное поглощение веществом света, в зависимости от его поляризации.
- Интерференция – это изменение интенсивности света при наложении двух или более световых волн.
- Разность хода световых лучей – это величина, характеризующая замедление скорости света, при прохождении через прозрачное вещество. Измеряется разность хода расстоянием проходимое светом в вакууме за то же время, которое необходимо для прохождения в исследуемом веществе, в исследуемых точках пространства.
- Коноскопия – это метод изучения оптических свойств анизотропных объектов в сходящихся лучах поляризованного света. При коноскопии ведётся наблюдения за изменением интерференционной картины при повороте анализатора. Вращая анализатор и поляризатор, друг относительно друга, исследователь наблюдает в микроскоп коноскопические фигуры, состоящие из изогир (это тёмные полосы, соответствующие направлению колебаний световых волн в поляризаторе) и изохром (это полосы разных интерференционных цветов, которые соответствуют направлениям движения лучей в кристалле с одинаковой разностью хода).
- Ортоскопия – это метод изучения оптических свойств анизотропных объектов в параллельных лучах поляризованного света.
- Плеохроизм – изменение наблюдаемой окраски некоторых анизотропных объектов при изменении угла наблюдения (изменение цвета кристаллов при повороте столика).
Поляризационный микроскоп - это микроскоп, предназначенный для исследования двойного лучепреломления поляризованного света, проходящего через анизотропную среду
Первый поляризационный микроскоп был сконструирован в 1863 году Генри Клифтоном Сорби и отличался от привычного нам оптического микроскопа, двумя призмами Николя, установленными в оптическом пути. Призма Николя пропускает через себя свет только в одном направлении и в одной плоскости, то есть плоско поляризованный свет, остальной свет, попавший в эти призмы полностью отражается и рассеивается. Эти призмы конструктивно ничем друг от друга не отличаются и выполняют роль поляризаторов (анализатора и поляризатора). Когда плоскость поляризации анализатора повёрнута на 90º, относительно плоскости поляризации поляризатора, исследователь наблюдает поляризационную картину двулучепреломляющего объекта, а все объекты, не обладающие двойным лучепреломлением - затемнены. В современных микроскопах, для получения большего количества информации могут использоваться ДИК призмы (совмещение рельефа с поляризационной картиной, для изучения неокрашенных образцов), компенсаторы (для количественной поляризации), круглый столик (для изучения плеохроизма) и простые поляроиды для несложных наблюдений (например в биологии и медицине).
Наиболее часто поляризация применяется в икроскопах для кристалографии, где свойства анизотропных объектов могут быть определены с помощью коноскопии и ортоскопии. Обратите внимание на сходство и различие коноскопии и ортоскопии: световой пучок, проходит через поляризатор (1), ограничивается апертурной диафрагмой (2), проходит через линзы конденсора (3); анализатор (который поворачивает исследователь) (8) и компенсаторы (7).
Рисунок 1 – Схема поляризационного микроскопа при: а) Ортоскопии б) Коноскопии
Условные обозначения: 1 - поляризатор, 2,6 - диафрагмы; 3 - конденсор; 4 - препарат; 5 - объектив; 7 - компенсатор; 8 - анализатор; 9 - линза Бертрана; 10 - фокальная плоскость окуляра; 11 - окуляр.
Наблюдаемая картина состоит из коноскопических фигур. коноскопические фигуры – состоят из изогир (это тёмные прямые или изогнутые полосы, в которых направления колебаний параллельны главным сечениям николей) и изохром (это полосы, окрашенные в различные интерференционные цвета. Каждая полоса соответствует направлениям лучей, образовавшихся при двулучепреломлении, и имеющим одинаковую разность хода).
Приведём пример: в пластинках одноосного кристалла, вырезанного перпендикулярно оптической оси, мы увидим изогиру в форме креста и концентрические кольца изохромы см. рис. 5.
Рисунок 5 – А) Коноскопические фигуры одноосного минерала кальцита Б) Двуосного минерала флогопита со вставленным компенсатором.
По характеру полученной интерференционной картины проводится измерение величины двойного лучепреломления, углов поворота плоскости поляризации, углов погасания, определение количества оптических осей и других характеристик. Все эти характеристики дают понять какой кристалл наблюдает исследователь, его строение. Для минералогии и кристаллографии сконструированы такие микроскопы как BX53P и H600P. Они оснащаются лучшей оптикой, свободной от напряжений и компенсаторами, изготовленными на современном оборудовании, исключающим люфт и зазоры при их установки в микроскоп.
Двулучепреломление применяется не только в кристаллографии, но и в медицине, биологии, криминалистике и металлографии, потому как исследователям важно быстро и точно выделять витамины, кислоты, минералы, напряжения в изотропных объектах, неметаллические включения в исходном образце и другие. Например, микроскопы для гистологии и цитологии оснащаются поляризаторами для выявления разного рода объектов. Круглые объекты с диаметром около 2,4 мкм, липоиды и капли, при скрещенных поляризаторах образуют интерференционную картину мальтийский крест. Не все вещества обладают одинаковыми свойствами лучепреломления при разных температурах, так, например, можно выделить 1) вещества приобретающие анизатропные свойства при охлаждении и теряющие их при нагревании: холестерин и его эфиры 2) не теряющие своих анизатропных свойств при нагревании: цереброзиды, фосфатиды, миелины. Такая изменчивость свойств обусловлена способностью вещества поддерживать кристаллическую структуру, т.к. именно она обуславливает двулучепреломление. Наблюдая анизатропные объекты в поляризационном микроскопе и определяя их концентрацию, можно диагностировать такие заболевания как: артрит, атеросклероз, липоидурия, цилинурия и липидоз по свечению липидов при скрещенных поляризаторах, а также подагру, мочекаменную болезнь, селикоз и асбестос по кристаллам мочевины, двуокиси кремния и асбестовым волокнам соответственно. Для гистологии и цитологии разработан микроскоп BX46, который оснащён низким столиком, мощным осветителем и регулируемый по высоте тубус, который избавит спину исследователя от затекания.
Окраску отличную от изотропных объектов, в поляризованном свете имеют: крахмал, целлюлоза, некоторые кислоты, витамин С, поэтому микроскопы для фармакологии и фармацевтики так же должны оснащаться поляризаторами. Фармакологический микроскоп, это и CX43, и BX43, и другие модели, потому что исследований в этой области с каждым годом всё больше,а новые объекты исследований требуют иного подхода.
В криминалистике важно отличить вкрапления зёрен кварца и других минералов от органики и других материалов, которые можно найти на месте преступления, поэтому микроскоп должен обязательно быть оснащён отражённым светом, чтобы рассматривать и непрозрачные объекты. Для криминалистики подойдёт микроскоп BX53M , так как он оснащается не только мощным источником проходящего света, но и таким же мощным осветителем отражённого света, а провставки для увеличения рабочего расстояния микроскопа, позволят проводить исследования очень больших объектов не проводя долгой предварительной подготовки.
В металлографии тоже применяются поляризационные микроскопы, но для подобных исследований достаточно знать наличие или отсутствие анизатропных объектов, а так же их пространственное распределение. Именно для классификации и подсчёта таких объектов, в металлографии можно использовать микроскопы VHX6000, BX53P с установленным Stream.
Гистологическое исследование - это исследование тканей под микроскопом. А цитологическое исследование отличается от гистологического тем, что при нём проводится не исследование ткани, а исследование клеток.
Виды микроскопии
Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.
Метод темного поля и его разновидности
Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры не окрашенного материала. При этом лучи от осветителя падают на препарат под косым углом, и объект исследования проявляется освещенным в темном поле..
Метод фазового контраста
При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные — фаза световой волны, что и используют для получения высоко контрастного изображения.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет изучать ультраструктурную организацию тканевых компонентов на основе анализа анизотропии и/или двойного лучепреломления
Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором
Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами.
Ультрафиолетовая микроскопия . Основана на применении ультрафиолетовых лучей с длиной волны менее 380 нм, что позволяет увеличить разрешающую способность объективов с 0,2…0,3 мкм до 0,11 мкм. Требует применения специальных ультрафиолетовых микроскопов, в которых используются ультрафиолетовые осветители, кварцевая оптика и преобразователи ультрафиолетовых лучей в видимую часть спектра. Многие вещества, входящие в состав клеток (например, нуклеиновые кислоты), избирательно поглощают ультрафиолетовые лучи, что используется для определения количества этих веществ в клетке.
Трансмиссионная микроскопия . В трансмиссионных микроскопах электроны проходят через образец. Энергия электронов сравнительно невелика (до 50 кВ); при этом происходит их рассеивание и поглощение. Для создания контрастного изображения применяются особые методы подготовки материала.
Сканирующие электронные микроскопы основаны на сканировании образца. При этом точно сфокусированный пучок электронов пробегает по поверхности образца, а отраженные электроны формируют изображение, подобное трехмерному. Разрешающая способность сканирующего микроскопа меньше, чем у трансмиссионного (5…20 нм).
Высоковольтные электронные микроскопы основаны на использовании электронов сверхвысоких энергий (до 1 МВ – одного миллиона вольт). Столь мощные пучки пробивают относительно толстые срезы (до 5 мкм), что позволяет использовать этот тип микроскопии для изучения целостных клеток.
Метод замораживания – скалывания.
Клетки замораживают при температуре жидкого азота (196 О С) в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов.
Культура тканей, микрургия.
Метод культуры клеток и тканей
заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели.
Микрургия (micrurgia; микр + ergon - работа, действие) - совокупность методических приемов и технических средств для осуществления операций на очень мелких объектах: одноклеточных организмах, отдельных клетках многоклеточных, внутриклеточных структурах.
Клеточная инженерия, понятие о гетерокарионе, гибридизация.
Гетерокарион — соматическая клетка, образованная в результате слияния родительских клеток с гаплоидными генетически различными ядрами. Образовавшиеся гетерокарионы дают начало двум одноядерным гибридным клеткам.
В 1965 году английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерокарионы, образованные клетками мыши и человека.
Гибридизация- процесс образования или получения гибридов , в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке
Из всего многообразия устройств для микроскопии, поляризационные микроскопы являются самыми сложными в техническом плане. Такое внимание к конструкции прибора по части технологичности обусловлено необходимостью получать изображение высочайшего качества, на которое непосредственно влияют конструкция оптической и осветительной частей микроскопа. Основная область использования поляризационных устройств для микроскопии - это изучение минералов, кристаллов, шлаков, анизотропных объектов, текстильной и огнеупорной продукции, а также других материалов, для которых свойственно двойное лучепреломление. На последнем принципе и построено формирование изображения в таких устройствах для микроскопии, в которых исследуемый образец облучается поляризационными лучами. При этом, анизотропные свойства образцов проявляются после изменения направления луча. Для этих целей, в конструкции поляризационных микроскопов предусмотрены вращающиеся в различных плоскостях относительно друг друга поляфильтры: анализатор поворачивается на 180 градусов, а поляризатор - на 360. Основной особенностью устройств для микроскопии в поляризационном свете является возможность проводить ортоскопические и коноскопические исследования, недоступные при использовании большинства других типов микроскопов.
Исследование образца под поляризационным микроскопом начинается с установки поляризатора в осветительной части микроскопа под конденсор, рядом с апертурной диафрагмой. При этом, анализатор находится между окуляром и объективом - за последним по ходу лучей света. При правильной настройке такого прибора для микроскопии, после скрещивания поляфильтров, видимое поле будет равномерно темным, образуя, так называемый, эффект погашения. По завершении настроек устройства, исследуемый образец закрепляется на предметном столике и проводится его изучение. Столики поляризационных микроскопов центрируются относительно оптической оси и могут поворачиваются на 360 градусов, а в подобных устройствах для лабораторных и исследовательских целей, так же имеют нониус. Оптика и осветительная система поляризационных микроскопов высочайшего качества и такой точности изготовления, что позволяет получать максимально четкое изображение без искажений. Часто в комплект устройств для проведения исследований образцов в поляризационном свете входят компенсатор и линза Бертрана. Первая дает возможность эффективно исследовать структуру минералов, а линза - увеличивать и сосредотачивать область наблюдения при появлении изменений изображения после поворота предметного столика. Сегодня на рынке представлены три основных типа таких устройств для микроскопии - это уже упомянутые исследовательские и лабораторные, а также рабочий поляризационный микроскоп.
Метод фазово-контрастной микроскопии
Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность(с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия)
Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой -- мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
Оглавление темы "Методы выделения бактерий. Микроскопия. Питательные среды для культивирования бактерий.":Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.
Рис. 11-4. Схема люминесцентного микроскопа .Интерференционная микроскопия
Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой - мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.
Рис. 11-5. Прямая иммунофлюоресценция
. Прямой метод предполагает использование помеченных флюоресцирующим красителем AT к интересующему Аг; AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации, что и позволяет визуализировать метка.
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.
Рис. 11-6. Непрямая иммунофлюоресценция
. Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг микроорганизма, вторые AT (связанные с меткой) специфически взаимодействуют с первыми AT, являющимися Аг ко вторым AT. Метод значительно чувствительнее, чем прямая иммунофлюоресценция, так как с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT.
Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11-5 и 11-6.
