По спектрам ЭПР можно определить валентность парамагнитного иона, симметрию его окружения, что в сочетании с данными рентгеновского структурного анализа дает возможность определить положение парамагнитного иона в кристаллической решетке. Значение энергетических уровней парамагнитного иона позволяет сравнивать результаты ЭПР с данными оптических спектров и вычислять магнитные восприимчивости парамагнетиков.
Метод ЭПР позволяет
определять природу и локализацию
дефектов решетки, например центров
окраски. В металлах и полупроводниках
возможен также ЭПР, связанный с изменением
ориентации спинов электронов проводимости.
Метод ЭПР широко применяется в химии и
биологии, где в процессе химических
реакций или под действием ионизирующего
излучения могут образовываться молекулы
с незаполненной химической связью-
свободные радикалы. Их g-фактор
обычно близок к
,
а ширина линии ЭПР
мала. Из-за этих качеств один из наиболее
устойчивых свободных радикалов (),
у которогоg=2,0036,
используется как стандарт при измерениях
ЭПР. В биологии ЭПР изучаются ферменты,
свободные радикалы в биологических
системах и металлоорганических
соединениях.
Эпр в сильных магнитных полях
Подавляющее число
экспериментальных исследований
парамагнитного резонанса выполнено в
магнитных полях, напряженность которых
меньше 20 кэ.
Между тем применение более сильных
статических полей и переменных полей
более высоких частот значительно
расширило бы возможности метода ЭПР,
увеличило бы даваемую им информацию. В
ближайшем будущем станут доступными
постоянные магнитные поля до 250 кэ
и импульсные
поля, измеряемые десятками миллионов
эрстед. Это означает что зеемановские
расщепления в постоянных полях будут
достигать примерно 25
,
а а в импульсных полях – величины еще
на два порядка большей. Лоу при помощи
спектрометра со сверхпроводящим магнитом
проводил измерения ЭПР в поляхH
0
65
кэ.
Прохоров с сотрудниками наблюдал сигналы
ЭПР на длине волны
=1,21мм
.
Большую пользу
сильные магнитные поля должны принести
для излучения редкоземельных ионов в
кристаллах, интервалы между штарковскими
подуровнями которых имеют порядок
10-100
.
Эффект ЭПР в обычных полях нередко
отсутствует из-за того, что основной
штарковский уровень оказывается
синглетом, или потому, что переходы
между зеемановскими подуровнями
основного крамерсова дублеты запрещены.
Эффект же благодаря переходам между
различными штарковскими подровнями,
вообще говоря, возможен. Далее,
кристаллическое поле в редкоземельных
кристаллах характеризуется большим
числом параметров, для определения
которых знанияg
-
тензора основного крамерсова дублета
недостаточно.
Сильные магнитные
поля могут быть использованы и для
изучения ионов группы железа, в
особенности, таких как
у
которых имеются расщепления порядка
10
100
.
В применении к обменно-связанным парам сильные магнитные поля позволят путем наблюдения эффекта, обусловленного переходами между уровнями с различными значениями результирующего спина S пары со спектроскопической точностью измерить параметр обменного взаимодействия J .
Парамагнитный резонанс в сильных магнитных полях будет обладать рядом особенностей. Эффекты насыщения намагниченности будут происходить при относительно высоких температурах. При не очень низких температурах поляризация ионных магнитных моментов будет настолько велика, что помимо внешнего магнитного поля в резонансные условия необходимо будет ввести поле внутреннее. Появится зависимость резонансных условий от формы образца.
Метод ЭПР приобрел большое значение в химии, физике, биологии, медицине, поскольку позволяет определять структуры и концентрации органических и неорганических свободных радикалов. Свободные радикалы могут быть созданы химическим методом, фотохимически или при действии излучения высокой энергии.
Спектр ЭПР дают свободные радикалы, молекулы с нечетным числом электронов, триплетные состояния органических молекул, парамагнитные ионы переходных металлов и их комплексы.
Метод ЭПР начал применятся в биологических исследованиях в 50-ые годы 20 в. Благодаря довольно высокой чувствительности и возможности в определении природы парамагнитных частиц этот метод нашел широкое применение для изучения целого ряда биологических процессов.
Помимо сигналов свободных радикалов в тканях наблюдается целый ряд сигналов металлов (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Эти металлы входят в состав металлопротеинов, принимающих участие в целом ряде ферментативных процессов. Железосодержащие белки (цитохромы, ферредоксины) являются компонентами электрон-транспортных цепей в митохондриях и хлоропластах.
Методом ЭПР исследован целый ряд ферментативных систем, обнаружены свободно-радикальные продукты субстратов. В ряде случаев оказалось возможным наблюдать за окислительно-восстановительными превращениями ионов металлов, входящих в активный центр фермента.
ЭПР-спектроскопия широко применяется в исследованиях фотосинтеза: изучается механизм первичных стадий разделения зарядов в реакционных центрах и дальнейший перенос электрона по цепи электронного транспорта.
Помимо изучения механизмов реакций, протекающих с участием парамагнитных частиц, метод ЭПР широко используют и для исследования структурно-динамических свойств макромолекул и биомембран.
В последнее время для изучения биологических и полимерных систем часто используются методы «парамагнитного зонда», «спиновых меток» и «спиновых ловушек». Все они основаны на использовании стабильных азотнокислых радикалов различного строения, а точнее на анализе изменений ширины линий спектров ЭПР, вызванных вращательной и поступательной диффузией этих радикалов.
Основная идея метода спиновых меток и зондов состоит в присоединении к той или иной функциональной группе белка свободного радикала и изучению характеристик его сигналов ЭПР. Наиболее удобны в этом отношении нитроксильные радикалы, содержащие свободнорадикальную группу:
где R 1 и R 2 – различные химические группировки.
Метод «спиновых меток» заключается в том, что к непарамагнитной молекуле стабильный радикал прикрепляется ковалентной или какой-либо другой связью так, чтобы свободная валентность оказалась незатронутой. Характер движения отчетливо проявляется в форме спектра и служит важным источником информации об исходной молекуле.
Если молекула встраивается в белковую молекулу и там удерживается с помощью электростатических сил или гидрофобных взаимодействий, то такая молекула называется спиновым зондом. Метод основан на исследовании вращательной и поступательной подвижности радикала-зонда в водных или органических средах или в матрице полимера. Подвижность радикала зависит от подвижности молекул окружающей среды, поэтому радикал является своеобразным молекулярным датчиком структурной и динамической информации о локальном окружении.
Форма сигнала ЭПР, даваемого спиновой меткой или зондом, зависит от микроокружения нитроксильного радикала и, в первую очередь, от вращательной подвижности той группы, в состав которой он входит.
Основной недостаток спиновых меток и зондов заключается в том, что хотя эти молекулы и невелики, всё же, включаясь в липидный бислой, они несколько изменяют его свойства.
В основе метода «спиновых ловушек» лежит реакция специально вводимой в исследуемую систему непарамагнитной молекулы (ловушки) с короткоживущим радикалом, при этом образуется стабильный радикал. Кинетическое поведение образующегося стабильного радикала и его структура дают сведения о кинетике и механизме процессов в изучаемой системе.
Объектами исследования в химии с применением ЭПР-спектроскопии являются: 1) свободные радикалы в промежуточных продуктах органических реакций; 2) кинетика реакций; 3) химия поверхностных явлений; 4) разрушение, происходящее в результате облучения; 5) полимеризация, обусловленная свободными радикалами; 6) свободные радикалы, замороженные при низких температурах; 7) металлы переменной валентности и их комплексы.
Метод ЭПР дает ценный вклад в исследование кинетики и механизмов химических реакций. Во-первых, измерение ширины линий в спектрах ЭПР можно использовать для определения констант скорости процессов с участием парамагнитных частиц, характеристическое время жизни которых лежит в интервале 10 -5 -10 -10 с. Во-вторых, метод ЭПР позволяет регистрировать с высокой чувствительностью в разных условиях парамагнитные частицы, что дает ценную информацию о механизмах реакций. В-третьих, спектрометр ЭПР можно использовать как аналитический прибор для детектирования в ходе реакций концентрации реагирующих парамагнитных молекул. Количество парамагнитных центров в образце пропорционально площади под спектром поглощения.
Метод ЭПР широко используется для исследования быстрых процессов, связанных с изменением молекулярной структуры радикалов. Эти процессы включают заторможенное вращение и конформационные переходы.
Для короткоживущих радикалов чувствительность метода может быть повышена путем использования проточной системы или непрерывного облучения. Спектры ЭПР нестабильных радикалов можно получить, зафиксировав их в стеклах, матрицах замороженных благородных газов или кристаллах.
Вопросы для собеседования
1. Теоретические основы метода.
2. Аналитические параметры ЭПР-спектра.
3. Спектрометры ЭПР.
4. Применение ЭПР.
Тестовые задания
1. Условие резонанса в методе ЭПР:
а) n= gH 0 (1-s) / 2p; б) δ = (ΔН/Н 0);·в)hn=gβH 0 ; г) δ = (Δν/ν 0)/(ΔН/Н 0).
2. Что происходит в момент резонанса в методе ЭПР:
а) происходит поглощение квантов излучения, переориентации спинов не происходит;
б) происходит поглощение квантов излучения и переориентации спинов, т.е. переход из нижнего энергетического состояния в верхнее и наоборот. Количество переходов снизу вверх больше числа переходов сверху вниз.
в) происходит поглощение квантов излучения и переориентации спинов, т.е. переход из нижнего энергетического состояния в верхнее и наоборот. Количество переходов сверху вниз больше числа переходов снизу вверх.
3. Параметры спектров ЭПР:
а) g-фактор, ширина полосы поглощения, интенсивность линии поглощения;
б) общее число сигналов, интенсивность сигналов, химический сдвиг, мультиплетность сигнала;
в) g-фактор, ширина полосы поглощения, интенсивность линии поглощения, СТС спектров ЭПР.
МАСС-СПЕКРОМЕТРИЯ
Данный метод принципиально отличается от спектроскопических методов. Методы масс-спектрометрии основаны на ионизации вещества, разделении ионов, согласно отношению (m/z ), и регистрации массы образующихся осколков.
Теоретические и экспериментальные основы масс-спектрометрии были заложены еще Д.Д. Томсоном, который впервые в 1912 г. создал прибор для получения масс-спектра положительных ионов. Однако его прибор имел низкое разрешение. Его ученик Ф. Астон в 1918 г. существенно повысил разрешение и на своем приборе впервые открыл изотопы элементов. Практически одновременно с Ф. Астоном в Чикаго А. Демпстер сконструирован первый масс-спектрометр, в котором анализатором служило поперечное магнитное поле, а ионные токи измерялись электрическими методами. Схема его используется и в современных приборах.
Ионизация молекул должна проводиться в таких условиях, при которых образовавшийся ион вне зависимости от метода ионизации не претерпевал бы никаких столкновений с другими молекулами или ионами. Это необходимо для установления взаимосвязи между свойствами иона и молекулы.
Методы ионизации
Ионизация может проводиться различными методами.
1. Метод ионизации электронным ударом (ЭУ).
Это наиболее распространенный метод получения ионов в связи с простотой и доступностью источников ионов и их высокой эффективностью. Допустим, что через пары вещества проходит поток электронов, энергию которых можно постепенно увеличивать. Если эта энергия достигнет определенного уровня, то при столкновении электрона с молекулой может произойти «выбивание» из нее электрона с образованием молекулярного иона:
многоатомная молекула молекулярный ион (катион-радикал)
Наименьшая энергия бомбардирующих электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией ионизации вещества. Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее связанный с ней электрон. Для органических молекул энергия ионизации составляет 9 ÷12 эВ.
Если энергия электронов значительно превышает энергию ионизации, то образующийся молекулярный ион получает избыточную энергию, которой может оказаться достаточно для разрыва в нем связей. Происходит распад молекулярного иона на частицы меньшей массы (фрагменты). Такой процесс называется фрагментацией . В практике масс-спектрометрии используются электроны с энергией 30÷100 эВ, что обеспечивает фрагментацию молекулярного иона.
Молекулярные ионы - это такие ионы, массы которых равны массе ионизируемой молекулы. К сожалению, нет прямых методов определения структуры ионов. Поэтому часто используют предположение о тождественности структуры молекулярного иона (М +) и нейтральной молекулы (М). Вероятность образования молекулярного иона больше для простых, малых молекул. С увеличением числа атомов в молекуле увеличивается вероятность фрагментации молекулярного иона.
Известны два основных типа фрагментации молекулярного иона - диссоциация и перегруппировка.
Диссоциация - распад молекулярного иона с сохранением последовательности связей. В результате процесса образуются катион и радикал:
Диссоциация углеводородов приводит к фрагментам с нечетными значениями отношения m/z.
Перегруппировка сопровождается изменением последовательности связей, в результате чего образуется новый катион-радикал меньшей массы и нейтральная устойчивая молекула (Н 2 О, СО, СО 2 и т.д.):
Перегруппировка углеводородов и кислородсодержащих соединений приводит к фрагменту с четным значением отношения m/z. Измерение массы образующихся осколков и их относительного количества позволяет получить ценную информацию о строении органических соединений.
Рассмотрим устройство масс-спектрометра (рис. 1). Масс-спектрометр должен содержать узлы для выполнения следующих функций: 1) ионизации пробы, 2) ускорение ионов электрическим полем, 3) распределение ионов согласно отношению m/z, 4) детектирование ионов по соответствующему электрическому сигналу.
Рис.1. Устройство масс-спектрометра
1 - источник электронов; 2 - ионизационная камера; 3 - ускорительные пластины (отрицательный потенциал); 4 - магнит; 5 - щель;
6 - коллектор ионов (детектор ионов)
Для получения масс-спектра пары вещества небольшими количествами с помощью специальной системы напуска вводятся в ионизационную камеру (2) , где поддерживается глубокий вакуум (давление 10 -6 мм рт. ст.). Молекулы вещества бомбардируются потоком электронов, излучаемых раскаленным катодом (1). Образующиеся ионы выталкиваются из ионизационной камеры небольшой разностью потенциалов (3). Получаемый поток ионов ускоряется, фокусируется сильным электрическим полем и попадает в магнитное поле (4).
В результате бомбардировки молекул вещества электронами образуются частицы, имеющие положительный или отрицательный заряд, а также нейтральные частицы. При прохождении потока частиц через магнитное поле нейтральные частицы не изменяют направления, а положительные и отрицательные отклоняются в разные стороны. Величины отклонения ионов пропорциональны заряду и обратно пропорциональны их массе.
Каждый отдельный ион, характеризуемый конкретной величиной m/z, при данной напряженности магнитного поля движется по собственной траектории. Интервал сканирования масс можно изменять, варьируя либо напряженностью магнитного поля, либо потенциалом электрического поля.
В обычной масс-спектрометрии принято регистрировать только частицы, имеющие положительный заряд, т.к. при бомбардировке молекул электронами положительно заряженных ионов обычно больше, чем отрицательно заряженных. Если необходимо изучать и отрицательно заряженные ионы, следует изменить знак потенциала ускорения (ускорительные пластины).
Если на выходе ионов из магнитного поля установить регистрирующее устройство, то частицы, различающиеся значениями m/z, будут давать раздельные сигналы. Интенсивность сигналов будет пропорциональна количеству частиц с данным значением m/z. Интенсивность сигналов определяется как их высота, выраженная в мм. Высота пика с максимальной интенсивностью принимается за 100 % (базовый пик), интенсивность остальных пиков пересчитывается пропорционально и выражается в процентах.
С ростом отношения m/z разница в отклонении магнитным полем частиц, различающихся на одну атомную единицу массы, уменьшается. В связи с этим важной характеристикой масс-спектрометров является их разрешающая способность (R) , определяющая максимальную массу ионов, различающихся на одну атомную единицу массы (для которой прибор разделяет пики не менее чем на 90%):
где М - максимальная масса, для которой перекрывание пиков менее 10%; ΔМ - одна атомная единица массы.
Стандартные приборы имеют R ≈ 5000/1, а для приборов с двойной фокусировкой потока ионов R ≈ 10000/1 и даже больше. Такие приборы способны уловить разницу в молекулярной массе ионов до 0,0001. Масс-спектрометр с двойной фокусировкой может легко разделить пики ионов с одинаковыми номинальными величинами молекулярных масс, но разным элементным составом. Например, может различить N 2 (28,0061), CO (27,9949), и C 2 H 4 (28,0313).
Установление эмпирической формулы по данным масс-спектров задача не простая, но ее можно решить, используя подходящий алгоритм. Для получения масс-спектра требуется ничтожно малое количество вещества - около 1 мкг.
2. Химическая ионизация (ХИ).
В этом методе образец до облучения пучком электронов разбавляют большим избытком «газа-реагента». Вероятность первичных ионизирующих столкновений между электронами и молекулами образца после этого настолько мала, что первичные ионы образуются почти исключительно из молекул реагента. В качестве реагентов обычно используют газы с низкой молекулярной массой, например, CH 4 , изо-C 4 H 10 , NH 3 и инертные газы (Ar, He). Вторичные ионы образуются в результате переноса атома водорода или электрона.
Если газом-реагентом служит метан, то реакции протекают в такой последовательности:
CH 4 + ē → CH 4 + + 2ē
CH 4 + + ē → CH 3 + + H + + 2ē
CH 4 + + CH 4 → CH 5 + + CH 3
CH 3 + + CH 4 → C 2 H 5 + + H 2
R-CH 3 + CH 5 + → R-CH 4 + + CH 4
где R-CH 3 - молекула исследуемого вещества.
Исследования показали, что частицы CH 5 + и C 2 H 5 + в сумме составляют около 90% ионов, присутствующих в этой системе. Масс-спектры, получаемые после химической ионизации, намного проще, содержат меньше пиков, и поэтому их часто легче интерпретировать.
ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЭПР) - резонансное поглощение электромагнитных волн веществами, содержащими парамагнитные частицы. Методы, основанные на ЭПР, нашли широкое применение в лабораторной практике. С их помощью изучают кинетику химических и биохимических реакций (см. Кинетика биологических процессов , Кинетика химическая), роль свободных радикалов в процессах жизнедеятельности организма в норме и при патологии (см. Радикалы свободные), механизмы возникновения и течения фотобиологических процессов (см. Фотобиология) и т. д.
Явление ЭПР было открыто советским ученым Б. К. Завойским в 1944 году. Электронный парамагнитный резонанс характерен только для парамагнитных частиц то есть частиц, способных намагничиваться при приложении к ним магнитного поля) с нескомпенсированным электронным магнитным моментом, который, в свою очередь, обусловлен собственным механическим моментом электрона - спином. Электронам присуще особого рода внутреннее движение, которое можно сравнить с вращением волчка вокруг своей оси. Связанный с ним момент количества движения называют спином. Благодаря спину электрон обладает постоянным магнитным моментом, направленным противоположно спину. В большинстве молекул электроны располагаются на орбиталях таким образом, чего их спины направлены противоположно, магнитные моменты скомпенсированы, и сигнал ЭПР от них наблюдать не удается. Если магнитное поле электрона не скомпенсировано спином другого электрона (то есть молекула содержит неспаренные электроны), то регистрируется сигнал ЭПР. Частицами с неспаренными электронами являются свободные радикалы, ионы многих металлов (железо, медь, марганец, кобальт, никель и др.), ряд свободных атомов (водород, азот, щелочные металлы и др.).
В отсутствие внешнего магнитного поля направление (ориентация) магнитного момента электрона в пространстве может быть любым; энергия такого электрона не зависит от ориентации его магнитного момента. В соответствии с законами квантовой механики во внешнем магнитном поле ориентация магнитного момента электрона не может быть произвольной - он может быть направлен либо по направлению магнитного поля, либо противоположно ему.
В соответствии с ориентацией магнитного момента электрона его энергия в магнитном поле также может принимать лишь два значения: минимальное Е1 - при ориентации магнитного момента «по полю» и максимальное Е2 - при его ориентации «против поля» и разница в энергиях этих состояний (дельта Е) вычисляется по формуле: ΔЕ = gβH, где β - магнетон Бора (единица измерения магнитного момента электрона), H - напряженность магнитного поля, g - константа, зависящая от электронной структуры парамагнитной частицы. Если на систему неспаренных электронов во внешнем магнитном поле подействовать электромагнитным излучением, энергия кванта которого равна ΔE, то под влиянием излучения электроны начнут переходить из состояния с меньшей энергией в состояние с большей энергией, что будет сопровождаться поглощением излучения веществом.
ЭПР относят к методам радиоспектроскопии, поскольку для наблюдения электронного парамагнитного резонанса применяются излучения в радиочастотном диапазоне электромагнитных волн.
ЭПР регистрируется с помощью специальных приборов - радиоспектрометров. В их состав входят: электромагнит, источник радиочастотного излучения, линия передачи излучения от источника к образцу (волновод), резонатор, в котором находится исследуемый образец, системы детектирования, усиления и регистрации сигнала. Наиболее распространены радиоспектрометры, в которых используются электромагнитные излучения с длинами волн 3,2 см или 8 мм.
Регистрация сигнала ЭПР производится следующим образом. Напряженность магнитного поля, создаваемого электромагнитом, линейно изменяется в определенных пределах. При значениях напряженности, отвечающих условию резонанса, образец поглощает энергию электромагнитного излучения. Линия поглощения (сигнал ЭПР) представляет собой зависимость мощности излучения, поглощенного образцом, от напряженности магнитного поля. В существующих радиоспектрометрах сигнал ЭПР регистрируется в виде первой производной линии поглощения.
Для описания и анализа спектров ЭПР используется ряд параметров, характеризующих интенсивность линий, их ширину, форму, а также положение в магнитном поле. Интенсивность линий ЭПР при прочих равных условиях пропорциональна концентрации парамагнитных частиц, что позволяет проводить количественный анализ.
При рассмотрении явления ЭПР следует учитывать, что магнитный момент неспаренного электрона взаимодействует не только с магнитным полем электромагнита, но и с магнитными полями, создаваемыми окружением электрона: другими неспаренными электронами, магнитными ядрами (см. Ядерный магнитный резонанс). Взаимодействие неспаренных электронов с ядрами часто приводит к расщеплению спектра ЭПР на ряд линий. Анализ таких спектров позволяет идентифицировать природу парамагнитных частиц, оценивать характер и степень их взаимодействия друг с другом.
Участие парамагнитных частиц в химических реакциях, молекулярное движение и другие кинетические эффекты также влияют на форму спектра ЭПР. Поэтому ЭПР используют для обнаружения, оценки количества и идентификации парамагнитных частиц, исследования кинетики химических и биохимических реакций и молекулярной динамики.
Благодаря своей универсальности ЭПР находит широкое применение в различных областях науки. Использование ЭПР в биологии и медицине обусловлено наличием в клетках, тканях и биол. жидкостях различных по природе парамагнитных центров. С помощью ЭПР было обнаружено наличие свободных радикалов практически во всех животных и растительных тканях. Источником свободных радикалов служат такие соединения, как флавины, коэнзим Q и другие вещества, выполняющие роль переносчиков электронов В реакциях энергетического обмена в растительной и животной клетке; парамагнитные центры, обнаруживаемые в изолированных тканях, принадлежат в основном электрон-транспортным цепям митохондрий, микросом, хлоропластов (см. Дыхание). Обнаружено, что содержание свободных радикалов в тканях коррелирует с их метаболической активностью. В многочисленных работах показано изменение количества свободных радикалов при различных патологических состояниях, например при онкогенезе (см.), развитии лучевых повреждений (см.), токсикозе (см. Интоксикация), что объясняется нарушением энергетического метаболизма при патологии (см. Биоэнергетика).
С помощью ЭПР в тканях животных и растений определяют парамагнитные ионы (железа, меди, марганца, кобальта и т. д.), которые входят в состав металлопротеидов, участвующих в реакциях переноса электронов по электронтранспортным цепям и ферментативном катализе, а также в кислородпереносящих пигментах (гемоглобине). С помощью ЭПР удается исследовать окислительно-восстановительные превращения ионов металлов и характер взаимодействия ионов с их окружением, что позволяет установить тонкую структуру металлосодержащих комплексов.
Патологические изменения тканей приводят к изменениям сигналов ЭПР металлопротеидов, что связывают с распадом парамагнитных комплексов металлов, изменением окружения парамагнитных ионов, переходом ионов в другие комплексы. Однако исследование природы парамагнитных центров тканей, особенно свободных радикалов, связано с определенными трудностями из-за сложности расшифровки спектров ЭПР.
С помощью ЭПР оказалось возможным исследовать механизмы ферментативных реакций (см. Ферменты). В частности, удается одновременно изучать как кинетику образования и расходования свободных радикалов в ходе ферментативных реакций, так и кинетику окислительно-восстановительных превращений металлов, входящих в состав ферментов, что позволяет устанавливать последовательность стадий ферментативной реакции.
Применение ЭПР при исследовании лучевого поражения в биол. объектах позволяет получать информацию о природе образующихся в биополимерах радикалов, о механизмах и кинетике радикальных реакций, развивающихся в облученных объектах и приводящих к биологическому эффекту. Метод ЭПР может быть применен в аварийной дозиметрии, например при случайном облучении людей для оценки дозы облучения, используя для этого предметы из зоны облучения.
Важное место занимает ЭПР в исследовании фотобиологических процессов, протекающих с участием свободных радикалов (см. Молекула , Радикалы свободные , Фотобиология , Фотосенсибилизация). С помощью ЭПР подробно изучают процессы образования свободных радикалов в белках, нуклеиновых кислотах и их компонентах при действии ультрафиолетового излучения, роль этих радикалов в фотодеструкции биополимеров (см. Свет). Применение ЭПР дало важную информацию о первичных механизмах фотосинтеза (см.). Показано, что первичной реакцией фотосинтеза является перенос электрона от возбужденной светом молекулы хлорофилла и образование катион-радикала хлорофилла. Идентифицирована и природа молекул, акцептирующих электрон, отдаваемый возбужденной молекулой хлорофилла.
ЭПР применяется также и для исследования структуры биологически важных макромолекул и биомембран. Например, ионы железа, входящие в состав гема в гемсодержащих белках, могут находиться в высокоспиновом состоянии (электроны на внешних орбитах не спарены, суммарный спин максимален) и низкоспиновом (внешние электроны полностью или частично спарены, спин минимален). Исследования особенностей сигналов ЭПР высокоспиновых и низкоспиновых состояний ионов железа в гемоглобине и его производных способствовали пониманию пространственной структуры молекулы гемоглобина.
Значительные успехи в изучении структуры биомембран и биополимеров были достигнуты после появления методов спиновых зондов и меток (см. Мембраны биологические). В качестве спиновых меток и зондов в основном используются стабильные нитроксильные радикалы (см. Радикалы свободные). Нитроксильный радикал может быть ковалентно связан с молекулами (спиновая метка) либо удерживаться в исследуемой системе за счет физических взаимодействий (спиновой зонд). Сущность заключается в том, что форма спектра ЭПР нитроксильных радикалов зависит от свойств микроокружения: вязкости, характера и молекулярного движения, локальных магнитных полей и др. Спин-метки, ковалентно связанные с различными группами биополимеров, являются индикатором состояния структуры биополимера. С помощью спиновых меток исследуются пространственная структура биополимеров, структурные изменения белков при денатурации, образовании комплексов фермент - субстрат, антиген - антитело и т.д.
С помощью метода спиновых зондов изучаются способы упаковки и подвижность липидов в биомембранах, липид-белковые взаимодействия, структурные переходы в мембранах, вызванные действием различных веществ и т.д. На основе исследования спиновых меток и зондов предложены методы определения лекарственных средств в биол. жидкостях, а также исследуются вопросы направленного транспорта лекарственных средств и т. д.
Таким образом, с помощью ЭПР показано широкое распространение электронных процессов в организме в норме и при возникновении какой-либо патологии. Создание теории и совершенствование техники метода ЭПР легло в основу квантовой электроники как раздела науки, привело к созданию молекулярных генераторов и усилителей радиоволн (мазеров) и света - лазеров (см.), нашедших широкое применение во многих областях народного хозяйства.
Блюменфельд Л. А., Воеводский В. В. и Семенов А. Г. Применение электронного парамагнитного резонанса в химии, Новосибирск, 1962, библиогр.; Вертц Дж. и Болтон Дж. Теория и практические приложения метода ЭПР, пер. с англ.. М., 1975, библиогр.; Ингрэм Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии, пер. с англ.. М., 1972; Калмансон А. Э. Применение метода электронного парамагнитного резонанса в биохимии, в кн.: Усп. биол. хим., под ред. Б. Н. Степаненко, т. 5, с. 289, М., 1963; Кузнецов А. Н. Метод спинового зонда. М., 1976; Лихтенштейн Г. И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии, М., 1974; Метод спиновых меток, под ред. Л. Берлинера, пер. с англ., М., 1979; Свободные радикалы в биологии, под ред. У. Прайора, пер. с англ., т. 1, с. 88, 178, М., 1979.
К. Н. Тимофеев.
ЭЛЕКТРОННЫЙ
ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС
(ЭПР) - резонансное поглощение (излучение) эл--магн. волн радиочастотного
диапазона (10 9 -10 12 Гц) парамагнетиками, парамагнетизм
к-рых обусловлен электронами. ЭПР - частный случай парамагн. резонанса и более
общего явления - магнитного резонанса
. Лежит в основе радио-спектроскопич.
методов исследования вещества (см. Радио-спектроскопия)
. Имеет синоним
- электронный спиновый резонанс (ЭСР), подчёркивающий важную роль в явлении
спинов электронов. Открыт в 1944 E. К. Завойским (СССР). В качестве парамагн.
частиц (в случае конденсированных сред-парамагн. центров), определяющих парамагнетизм,
могут выступать электроны, атомы, молекулы, комплексные соединения, дефекты
кристалла, если они обладают отличным от нуля магнитным моментом
. Источником
возникновения магн. момента могут служить неспаренный спин или отличный от нуля
суммарный спин (момент кол-ва движения) электронов.
В постоянных магн. полях
в результате снятия вырождения у парамагн. частицы возникает система магн. (спиновых)
подуровней
(см. Зеемана эффект
).Между ними под действием эл--магн. излучения возникают
переходы, приводящие к поглощению (излучению) фотона с частотой w ij =
|
|/.В
случае одного электрона в постоянном магн. поле H
энергии подуровней
= bg
bH/
2
и соответственно частота ЭПР w определяется соотношением
где g - фактор спектроскопич.
расщепления; b - магнетон Бора; обычно, H
= 10 3 5-10 4 Э;
g2.
Экспериментальные методы
. Спектрометры ЭПР (радиоспектрометры) работают в сантиметровом и миллиметровом
диапазонах длин волн. Используется техника СВЧ-диапазона - генератор (обычно
клистрон
),система волноводов и резонаторов с детектирующим устройством.
Образец объёмом в неск. мм 3 помещается в область резонатора, где
составляющая эл--магн. волны (обычно магнитная), вызывающая переходы, имеет
пучность. Резонатор устанавливается между полюсами электромагнита - источника
постоянного магн. поля. Резонансное условие типа (1) обычно достигается путём
изменения напряжённости поля H
при фиксированном значении частоты генератора
w. Значение магн. поля при резонансе (H
р) в общем случае
зависит от ориентации вектора H
по отношению к образцу. Сигнал
поглощения в виде типичного колоколообраз-ного всплеска или его производной
(рис. 1) наблюдается с помощью осциллоскопа или самописца. Наиб. часто исследуется
сигнал поглощения, пропорциональный мнимой части динамической магн. восприимчивости
(c"") образца. Однако в ряде случаев регистрируется её действительная
часть (c"), определяющая долю намагниченности, меняющуюся синфазно с магн.
компонентой эл--магн. волны. ЭПР может проявляться в виде микроволновых аналогов
оптич. эффектов Фарадея и Коттона - Мутона. Для их регистрации используются
волноводы, в конце к-рых устанавливаются спец. антенны, вращающиеся вокруг оси
волновода и измеряющие поворот плоскости поляризации или эллиптичность волны,
вышедшей из образца. Широкое распространение получили импульсные методы, позволяющие
анализировать временные зависимости сигналов ЭПР (т. н. спиновую индукцию и
спиновое эхо
).Существует и ряд др. методик для изучения релаксац. процессов,
в частности для измерения времён релаксации.
Рис. 1. Электронный
парамагнитный резонанс: а
- парамагнитная
частица со спином S=
1 / 2 , помещён
ная
во внешнее магнитное поле, имеет два подуровня
(
и ),
каждый из которых изменяется пропор
ционально
полю H
и зависит от его ориентации по
отношению
к кристаллографическим осям, задавае
мой
углами q и f. При резонансных значениях магнит
ного
поля H
р1 и H
р2 (углы q 1 , (j 1
и q 2 , j 2) разность
становится равной кванту энергии
СВЧ
-излучения.
При этом в спектре поглощения (б
)наблю
даются
характерные всплески вблизи Н р
1 и H p
2
(при
ведены
сигнал поглощения и его производная)
.
Теоретическое описание
. Для описания спектра ЭПР используется спиновый гамильтониан
,к-рый
для каждого конкретного
случая имеет свой вид. В общем случае он может быть представлен в форме, учитывающей
все возможные взаимодействия парамагн. частицы (центра):
где описывает
взаимодействие с внеш. магн. полем H
;
- взаимодействие с внутрикристаллич. электрич. полем; -
с магн. моментом собственного и окружающих ядер (сверхтонкое взаимодействие
и суперсверхтонкое взаимодействие); -
спин-спиновые взаимодействия
парамагн. центров между собой (обменное
взаимодействие, диполь-дипольное и др.); -взаимодействие
с приложенным внеш. давлением P
(деформациями); -с
внеш. электрич. полем E
. Каждое слагаемое, входящее в (2),
может состоять из неск. членов, вид к-рых зависит от величины электронных и
ядерных спинов и локальной симметрии центра. Часто встречающиеся выражения имеют
вид;
где g, a, A, J, С, R
-параметры
теории, S
(i}
и I
(k
)
- i
-й и k
-й спины электронов и ядра; -единичная
матрица. Спиновый гамильтониан (2) обычно относят к одному электронному или
электронно-колебат. терму (обычно основному), предполагая, что другие термы
отстоят от него на величину, значительно превышающую энергию кванта ЭПР-перехода.
Но в ряде случаев, напр. при наличии Яна-Теллера эффекта
, возбуждённые
термы могут находиться достаточно близко и их необходимо учитывать при описании
спектров ЭПР. Тогда для сохранения формализма спинового гамильтониана можно
ввести эфф. спин (S
эф), связанный с общим числом состояний
всех уровней (r
)соотношением r
= 2S
эф +1. Другой
подход возможен в рамках метода матрицы возмущения: находится полная матрица
оператора возмущения на всех состояниях учитываемых уровней.
Каждое из слагаемых (2)
может быть разделено на две части: статическую и динамическую. Статич. часть
определяет положение линий в спектре, динамическая - вероятности квантовых переходов,
в т. ч. обусловливающих и ре-лаксац. процессы. Энергетич. структуру и волновые
ф-ции находят, решая систему ур-ний, соответствующую (2). Число ур-ний равно
где n
и p
-число
фигурирующих в (2) спинов электронов и ядер. Обычно S
и I
принимают
значения от 1 / 2 до 7 / 2 ; п=
1,
2; p=
l-50, что указывает на возможность существования секулярных ур-ний
высокого порядка. Для преодоления техн. трудностей при диагонализации (2) используют
приближённые (аналитические) расчёты. Не все слагаемые (2) одинаковы по величине.
Обычно и
превосходят др. члены, а
и значительно
меньше предыдущих. Это позволяет развить теорию возмущений в неск. этапов. Кроме
того, разработаны спец. программы для ЭВМ.
Цель феноменологич. теории
- нахождение для определ. перехода выражения для H
р в ф-ции
параметров спинового гамильтониана и углов, характеризующих ориентацию внеш.
полей относительно кристаллографич. осей. Сопоставлением (H
р) теор
с (H
р) эксп устанавливается правильность выбора
(2) и находятся параметры спинового гамильтониана.
Параметры спинового гамильтониана
рассчитываются независимо с помощью методов квантовой механики, исходя из определ.
модели парамагн. центра. При этом используют теорию кристаллич. поля, метод
молекулярных орбиталей, др. методы квантовой химии
и теории твёрдого
тела. Осн. трудность этой проблемы состоит в
определении электронной энергетич. структуры и волновых ф-ций парамагн. центров.
Если эти составляющие ур-ния Шрёдингера найдены, а операторы возмущения известны,
задача сводится к вычислению лишь соответствующих матричных элементов. В силу
сложности всего комплекса проблем полных расчётов параметров спинового гамильтониана
проведено пока мало и не во всех из них достигнуто удовлетворитю согласие с
экспериментом. Обычно ограничиваются оценками по порядку величины, используя
приближённые ф-лы.
Спектр ЭПР (число линий,
их зависимость от ориентации внеш. полей относительно кристаллографич. осей)
полностью определяется спиновым гамильтонианом. Так, при наличии лишь зеемановского
взаимодействия выражение для энергии имеет вид=g
bH +
M
, где M
- квантовое число оператора ,
принимающее 2S
+1 значений: - S, - S+
1, .... S
-1,
S. Магн. составляющая эл--магн. волны в данном случае вызывает лишь переходы
с правилами отбора DM = b 1, и, в силу эквидистантности уровней, в спектре
ЭПР будет наблюдаться одна линия. Нарушение эквидистантности возникает за счёт
др. слагаемых спинового гамильтониана. Так, аксиально симметричное слагаемое
из , характеризуемое
параметром D
, добавляет к
член 
,
H
р оказывается зависящим
от M
, и в спектре будет наблюдаться 2S
линий. Учёт слагаемого
AS z I z
из
приводит к добавке (D
) ст
= АМт
, где т
- квантовое число оператора I z ; H
р
будет зависеть от m
, и в спектре ЭПР будет 2I+
1 линия. Другие
слагаемые из (2) могут приводить к дополнительным, "запрещённым"
правилам отбора (напр., DM
= b2), что увеличивает число линий в
спектре.
Специфическое расщепление
линий возникает под действием электрич. поля (слагаемое ).
В кристаллах часто (корунд, вольфрамиты, кремний) существуют инверсионно неэквивалентные
положения, в к-рых могут с равной вероятностью находиться примесные ионы. Так
как магн. поле нечувствительно к операции инверсии, оно эти положения не различает,
и в спектре ЭПР линии от них совпадают. Приложенное к кристаллу электрич. поле
для разных неэквивалентных положений в силу их взаимной инвертированности будет
направлено в противоположные стороны. Поправки к H
р (линейные
по E
)от разных положений будут с противоположными знаками, и смешение
двух групп линий проявится в виде расщепления.
В отсутствие магн. поля
( =0) расщепление
уровней, называемое начальным, обусловлено др. членами (2). Число возникающих
уровней, кратность их вырождения зависят от величины спина и симметрии парамагн.
центра. Между ними возможны переходы (соответствующее явление получило назв.
б е с п о л е в о г о р е з о н а н с а). Для его осуществления можно менять
частоту v эл--магн. излучения, либо при v
= const менять расстояние между
уровнями внеш. электрич. полем, давлением, изменением темп-ры.
Определение симметрии
парамагнитного центра
. Угл. зависимость H
р (q, f)
отражает симметрию спинового гамильтониана, к-рая в свою очередь связана с симметрией
парамагн. центра. Это даёт возможность по виду ф-ции H
р (q,
f), найденной экспериментально, определять симметрию центра. В случае высокосимметричных
групп (О h , T d , C
4u , и др.) функция H
р
(q, f) обладает рядом характерных особенностей: 1) положения экстремумов
для линий разных переходов совпадают; 2) расстояние между экстремумами равно
p/2 (эффект ортогональности); 3) ф-ция H
р симметрична
относительно положений экстремумов и др. В случае низкосимметричных групп (C
1 ,
C
2 , C
3 и др.) все эти закономерности нарушены
(эффекты низкой симметрии). Эти эффекты используются для определения структуры
дефектов.
Обычному ЭПР соответствует
спиновый гамильтониан, не учитывающий электрич. полей (=0).
В него входят лишь операторы момента кол-ва движения и магн. поля. В силу их
псевдовекторной природы макс. число несовпадающих спиновых гамильтонианов будет
равно 11 (из 32 возможных точечных групп). Это приводит к неоднозначности
в определении симметрии парамагн. центров, к-рую можно устранить, используя
внеш. электрич. поле. Линейный по E
оператор
различен для разных точечных групп, не обладающих центром инверсии (для инверсионных
центров =0).
На 1-м этапе из экспериментов без поля E
определяется совокупность групп
с одним и тем же гамильтонианом, соответствующая симметрии спектра обычного
ЭПР. На 2-м этапе используется поле E
и учитывается то обстоятельство,
что в каждую совокупность групп входит лишь одна группа с центром инверсии.
Исследование неупорядоченных
систем
. Наряду с изучением парамагн. центров в совершенных кристаллах ЭПР
применяют и для исследования неупорядоченных систем
(порошки, стёкла,
растворы, кристаллы с дефектами). Особенностью таких систем является неодинаковость
(неоднородность) условий в местах расположения центров из-за различий во внутр.
электрич. (магн.) полях и деформациях, вызванных структурными искажениями кристалла;
неэквивалентности ориентации парамагн. центров по отношению к внеш. полям; неоднородности
последних. Это приводит к разбросу параметров спинового гамильтониана и как
следствие к неоднородному уширению линий ЭПР. Изучение этих линий позволяет
получить информацию о характере и степени дефектности кристалла. Неоднородное
уширение любой природы можно рассматривать с единой точки зрения. Общее выражение
для формы линии имеет вид:
где y - функция, описывающая
исходную форму линии без учёта возмущающих факторов; V
(F)
- вероятность перехода в единицу времени; r(F
) - ф-ция распределения
параметров F(F
1 , F
2 , .·., F k)
, характеризующих механизмы уширения (компоненты полей, деформаций, углы).
Так, в случае хаотически ориентированных парамагн. центров (порошки) под F
следует понимать углы Эйлера, характеризующие ориентацию частицы порошка
по отношению к системе координат, связанной с внеш. полями. На рис. 2 приведён
типичный спектр ЭПР порошка для спинового гамильтониана
вида 
Вместо
угл. зависимости одиночной
узкой линии, присущей парамагн. центрам
в монокристаллах, в этом случае возникает ориентационно
уширенная огибающая линия.
Рис. 2. Сигнал электронного
парамагнитного резонан
са
хаотически ориентированных парамагнитных центров. Линия поглощения (а
)
и её производная (б
) в
случае ромбической симметрии спинового гамильто
ниана.
Характерные точки спектра связаны с параметрами спинового гамильтониана соотношением
H pi
=w/bg iii
.
Релаксационные процессы
. ЭПР сопровождается процессами восстановления нарушенного эл--магн. излучением
равновесия в среде, соответствующего распределению Больцмана. Эти релаксац.
процессы обусловлены связью между парамагн. центром и решёткой, а также центров
между собрй. Соответственно различают с п и н-р е ш ё-т о ч н у ю и с п и н-с
п и н о в у ю релаксации. Если переходы под действием эл--магн. волны преобладают,
наступает явление насыщения (выравнивание населённостей уровней),
проявляющееся в уменьшении сигнала ЭПР. Релаксац. процессы характеризуются временами
релаксации и описываются кинетич. ур-ниями (см. Кинетическое уравнение основное)
. В случае двух уровней i
и j
ур-ния для населённостей n i
и n j
- имеют вид
где a =
u 0 ij
+
u ij , b =
u 0 ji +
u ji
, u 0 ij
и u ij
-вероятности перехода
в единицу времени с уровня i
на уровень j
под действием эл--магн.
волны и релаксац. механизмов соответственно (
u 0 ij
=
u 0 ji)
. Время релаксации T
р
определяется выражением T
p = (u ij
+u ji
) -1
и характеризует скорость установления равновесия. Релаксац. процессы, определяя
времена жизни частиц на спиновых уровнях, приводят к их уширению, что сказывается
на ширине и форме линии ЭПР. Это уширение, к-рое одинаковым образом проявляется
у всех парамагн. центров, принято называть однородным. Оно определяет, в частности,
ф-цию y, входящую в (3).
Двойные резонансы
. Для
описания спиновой системы введено понятие с п и н о в о й т е м п е р а т у
р ы Т s
. Определяющая распределение Больцмана связь между населённостью
уровней и темп-рой обобщена на случай неравновесных населённостей. Из неё при
произвольных соотношениях населённостей верх. (п в
)и ниж.
(n
н) уровней следует, что Т s =-()/ln(n
в /n
н). При n
в
= n
н (насыщение) T s =
,а
при n
в >n
н величина T s <
0. Возможность создания неравновесной населённости и, в частности, ситуаций,
при к-рых T s =
и T
s <0, привело к развитию двойных резонансов на базе
ЭПР. Они характеризуются тем, что при наличии многоуровневой системы осуществляются
резонансные переходы одновременно (или в опре-дел. последовательности) на двух
частотах (рис. 3). Цель осуществления двойных резонансов: увеличение интенсивности
поглощения за счёт увеличения разности населённостей (рис. 3, а);
получение
источника эл--магн. излучения путём создания на верхнем уровне большей населённости,
чем на нижнем (рис. 3, б)
. Принцип усиления сигнала лёг в основу реализации
ряда двойных резонансов в случаях, когда в системе имеются спины разных сортов.
Так, при наличии электронных и ядерных спинов возможен двойной э л е к т р о
н н о-я д е рн ый р е з о н а н с (ДЭЯР). Сверхтонкое расщепление уровней обычно
значительно меньше зеемановского. Это создаёт возможность усиливать переходы
между сверхтонкими подуровнями путём насыщения спин-электронных переходов. В
методе ДЭЯР повышается не только чувствительность аппаратуры, но и её разрешающая
способность, т. к. сверхтонкие взаимодействия с каждым ядром можно наблюдать
непосредственно в соответствующем спин-ядерном переходе (в то время как анализ
сверхтонкой структуры по спектру ЭПР во многих случаях затруднён из-за перекрывания
линий). Благодаря этим преимуществам ДЭЯР нашёл широкое применение в физике
твёрдого тела, и в частности в физике полупроводников. С его помощью удаётся
проанализировать ядра
многих координац. сфер вблизи дефекта, что позволяет однозначно определить ею
природу и свойства. Двойные резонансы, связанные с получением источников эл--магн.
излучения, легли в основу работы квантовых генераторов, что привело к созданию
и развитию нового направления - квантовой электроники.
Рис. 3. Двойной резонанс
в многоуровневой системе
. Выделены 3 уровня, для которых
и n
1 0 - n
0 2 >>п
0 2 -
п
0 3 (п
0 -равновесное значение);
а
- усиление
поглощения; интенсивным электромагнитным излучением
насыщаются уровни 1 и 2, так что n
1 n
2
= (n
0 1 +
n
0 2)/2; в результате п
2 - п
3
увеличивается на (n
0 1 - n
0 2 )/
2, и сигнал поглощения на частоте v
32 резко возрастает;
б
-мазерный
эффект; насыщение уровней 1 и 3 приво
дит
к необходимому условию [n
3 -n
2 (n
0 1 -n
0 2)/2>0]
для
генерирования
эл--магн. излучения на частоте v
32 ·
Заключение
. ЭПР
нашёл широкое применение в разл. областях физики, химии, геологии, биологии,
медицине. Интенсивно используется для изучения поверхности твёрдых тел, фазовых
переходов, неупорядоченных систем. В физике полупроводников с помощью ЭПР исследуются
мелкие и глубокие точечные примесные центры, свободные носители заряда, носитель-примесные
пары и комплексы, радиац. дефекты, дислокации, структурные дефекты, дефекты
аморфизации, межслойные образования (типа границ Si - SiO 2), изучаются
носитель-примесное взаимодействие, процессы рекомбинации, фотопроводимость и
др. явления.
Лит.: Альтшулер С. А., Козырев Б. M., Электронный парамагнитный резонанс соединений элементов промежуточных групп, 2 изд., M., 1972; Пул Ч., Техника ЭПР-спектроскопии, пер. с англ., M., 1970; Абрагам А., Блини Б., Электронный парамагнитный резонанс переходных ионов, пер. с англ., г. 1-2, M., 1972-73; Мейльман M. Л., Самойлович M. И., Введение в спектроскопию ЭПР активированных монокристаллов, M., 1977; Электрические эффекты в радиоспектроскопии, под ред. M. Ф. Дей-гена, M., 1981; Ройцин А. Б., Маевский В. H., Радиоспектроскопия поверхности твердых тел, К., 1992; Радиоспектроскопия твердого тела, под ред. А. Б. Ройцина, К., 1992. А. Б. Ройцин .
Метод электронного парамагнитного резонанса является основным методом для изучения парамагнитных частиц. К парамагнитным частицам, имеющим важное биологическое значение, относятся два основных типа - это свободные радикалы и комплексы металлов переменной валентности (таких, как Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. Е. К. Завойским при исследовании взаимодействия электромагнитного излучения микроволнового диапазона с солями металлов.
В основе метода ЭПР лежит поглощение электромагнитного излучения радиодиапазона неспаренными электронами, находящимися в магнитном поле.
Метод ЭПР позволяет нам изучать свойства парамагнитных центров посредством регистрации спектров поглощения электромагнитного излучения этими частицами. Зная характеристики спектров, можно судить о свойствах парамагнитных частиц.
К основным характеристикам спектров относятся амплитуда, ширина линии, g-фактор и сверхтонкая структура спектров.
Применение спиновых меток
Спиновые метки - химически стабильные парамагнитные молекулы, которые используются в качестве молекулярных зондов для изучения структуры и молекулярной подвижности различных физико-химических и биологических систем. Суть метода спиновых меток заключается в следующем. В исследуемую систему вводят в качестве спиновых зондов парамагнитные молекулы, которые дают характерные сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Сигналы ЭПР спиновых меток зависят от их молекулярной подвижности и физико-химических свойств ближайшего окружения. Поэтому, наблюдая за сигналами ЭПР молекулярных зондов, можно изучать структурные характеристики исследуемой системы и динамику происходящих в ней молекулярных процессов. Термин "спиновые метки" происходит от английского слова "spin" (веретено, волчок), которым называют собственный механический момент электрона. Электрон, как известно из квантовой механики, обладает механическим моментом, равным величине " /2, и собственным магнитным моментом, где " - постоянная Планка, e и m - заряд и масса электрона, с - скорость света. Парамагнитные свойства молекулярных зондов определяются наличием в них неспаренного электрона, обладающего спином и являющегося источником сигнала ЭПР. В качестве спиновых меток обычно используют стабильные нитроксильные радикалы. Все молекулы спиновых меток, несмотря на разнообразие их химического строения, как правило, содержат одинаковый парамагнитный фрагмент - химически стабильный нитроксильный радикал (>N-OJ). На этом радикале локализован неспаренный электрон, служащий источником сигнала ЭПР. Конкретный выбор спиновых меток определяется задачей исследования. Так, например, для того чтобы с помощью спиновых меток следить за конформационными перестройками белков, молекулы метки обычно "пришивают" к определенным участкам белка. В этом случае спиновая метка должна содержать специальную реакционную группу, которая может образовать ковалентную химическую связь с аминокислотными остатками молекулы белка. Для изучения свойств искусственных и биологических мембран обычно используют жирорастворимые спиновые метки, способные встраиваться в липидный слой мембраны.
Явление электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) заключается в резонансном поглощении электромагнитного излучения в диапазоне радиочастот веществами, помещенными в постоянное магнитное поле, и обусловленное квантовыми переходами между энергетическими подуровнями, связанными с наличием магнитного момента у электронных систем. Также ЭПР называют электронный спиновый резонанс (ЭСР), магнитный спиновый резонанс (МСР) и, среди специалистов, работающих с магнитно-упорядоченными системами, ферромагнитный резонанс (ФМР).
Явление ЭПР можно наблюдать на:
- * атомах и молекулах, которые на своих орбиталях имеют нечетное количество электронов -- H, N, NO2 и др.;
- * химических элементах в различных зарядовых состояниях, у которых не все электроны на внешних орбиталях участвуют в образовании химической связи - прежде всего, это d- и f-элементы;
- * свободных радикалах - метильный радикал, нитроксильные радикалы и др.;
- * электронных и дырочных дефектах, стабилизирующихся в матрице веществ, - O-, O2-, CO2-, CO23-, CO3-, CO33- и многих других;
- * молекулах с четным числом электронов, парамагнетизм которых обусловлен квантовыми явлениями распределения электронов по молекулярным орбиталям - О2;
- * наночастицах-суперпарамагнетиках, образующихся при растворении или в сплавах, обладающих коллективным магнитным моментом, которые ведут себя подобно электронному газу.
Структура и свойства спектров ЭПР
Поведение магнитных моментов в магнитном поле зависит от различных взаимодействий неспаренных электронов, как между собой, так и с ближайшим окружением. Важнейшими из них считаются спин-спиновые и спин-орбитальные взаимодействия, взаимодействия между неспаренными электронами и ядрами, на которых они локализуются (сверхтонкие взаимодействия), взаимодействия с электростатическим потенциалом, создаваемым ионами ближайшего окружения в месте локализации неспаренных электронов и другие. Большинство перечисленных взаимодействий приводит к закономерному расщеплению линий. В общем случае спектр ЭПР парамагнитного центра является многокомпонентным. Представление об иерархии основных расщеплений можно получить из следующей схемы (определения используемых обозначений даны ниже):
Основными характеристиками ЭПР-спектра парамагнитного центра (ПЦ) являются:
- * количество линий в спектре ЭПР конкретного ПЦ и их относительные интенсивности.
- * Тонкая структура (ТС). Число линий ТС определяется величиной спина S ПЦ и локальной симметрией электростатического поля ближайшего окружения, а относительные интегральные интенсивности определяются квантовым числом mS (величина проекции спина на направление магнитного поля). В кристаллах расстояние между линиями ТС зависит от величины потенциала кристаллического поля и его симметрии.
- * Сверхтонкая структура (СТС). Линии СТС от конкретного изотопа имеют приблизительно одинаковую интегральную интенсивность и практически эквидистантны. Если ядро ПЦ имеет несколько изотопов, то каждый изотоп дает свой набор линий СТС. Их количество определяется спином I ядра изотопа, около которого локализован неспаренный электрон. Относительные интенсивности линий СТС от различных изотопов ПЦ пропорциональны естественной распространенности этих изотопов в образце, а расстояние между линиями СТС зависит от величины магнитного момента ядра конкретного изотопа, константы сверхтонкого взаимодействия и степени делокализации неспаренных электронов на этом ядре.
- * Суперсверхтонкая структура (ССТС). Число линий ССТС зависит от числа nл эквивалентных лигандов, с которыми взаимодействует неспаренная спиновая плотность и величины ядерного спина Iл их изотопов. Характерным признаком таких линий также является распределение их интегральных интенсивностей, которое в случае Iл = 1/2 подчиняется закону биномиального распределения с показателем степени nл. Расстояние между линиями ССТС зависит от величины магнитного момента ядер, константы сверхтонкого взаимодействия и степени локализации неспаренных электронов на этих ядрах.
- * спектроскопические характеристики линии.
Особенностью спектров ЭПР является форма их записи. По многим причинам спектр ЭПР записывается не в виде линий поглощения, а как производная от этих линий. Поэтому, в ЭПР-спектроскопии принята несколько иная, отличная от общепринятой, терминология для обозначения параметров линий.
Линия ЭПР поглощения и ее первая производная: 1- гауссова форма; 2- лоренцева форма.
- * Истинная линия - д-функция, но с учетом релаксационных процессов имеет форму Лоренца;
- * Линия - отражает вероятность процесса резонансного поглощения электромагнитного излучения ПЦ и определяется процессами, в которых участвуют спины;
- * Форма линии - отражает закон распределения вероятности резонансных переходов. Поскольку, в первом приближении, отклонения от резонансных условий носят случайный характер, форма линий в магниторазбавленных матрицах имеет гауссову форму. Наличие дополнительно обменных спин-спиновых взаимодействий приводит к лоренцевой форме линии. В общем случае форма линии описывается смешанным законом;
- * Ширина линии - ДВmax - cоответствует расстоянию по полю между экстремумами на кривой линии;
- * Амплитуда линии - Imax - соответствует по шкале амплитуды сигнала расстоянию между экстремумами на кривой линии;
- * Интенсивность - I0 - значение вероятности в точке МАХ на кривой поглощения, вычисляется при интегрировании по контуру линии записи;
- * Интегральная интенсивность - площадь под кривой поглощения, пропорциональна количеству парамагнитных центров в образце и вычисляется путем двойного интегрирования линии записи, сначала по контуру, затем по полю;
- * Положение линии - В0 - соответствует пересечению контура производной dI/dB с нулевой линией (линией тренда);
- * положение линий ЭПР в спектре.
Согласно выражению hн = gвB, определяющему условия резонансного поглощения для ПЦ со спином S = 1/2, положение линии электронного парамагнитного резонанса можно охарактеризовать значением g-фактора (аналог фактора спектроскопического расщепления Ланде). Величина g-фактора определяется как отношение частоты н, на которой проводилось измерение спектра к величине магнитной индукции В0, при которой наблюдался максимум эффекта. Следует отметить, что для парамагнитных центров g-фактор характеризует ПЦ как целое, т.е. не отдельную линию в спектре ЭПР, а всю совокупность линий, обусловленных исследуемым ПЦ.
В ЭПР экспериментах фиксируется энергия электромагнитного кванта, то есть частота н, а магнитное поле В может изменяться в широких пределах. Выделяются некоторые, довольно узкие, диапазоны СВЧ-частот, в которых работают спектрометры.
