Microscopía. ¿Qué se puede ver con un microscopio óptico? Usando microscopía óptica

La microscopía óptica es el método más antiguo y, al mismo tiempo, uno de los más comunes para estudiar y estudiar células vegetales y animales. Se supone que el inicio del estudio de las células fue precisamente con la invención del microscopio óptico óptico. La principal característica de un microscopio óptico es la resolución del microscopio óptico, que está determinada por la longitud de onda de la luz. El límite de resolución de un microscopio óptico está determinado por la longitud de onda de la luz; un microscopio óptico se utiliza para estudiar estructuras que tienen dimensiones mínimas iguales a la longitud de onda de la radiación luminosa. Muchas células constituyentes tienen una densidad óptica similar y requieren un tratamiento previo antes de microcopiarlas; de lo contrario, son prácticamente invisibles con un microscopio óptico convencional. Para hacerlos visibles se utilizan diversos colorantes con cierta selectividad. Con la ayuda de colorantes selectivos es posible estudiar con más detalle la estructura interna de la célula.

Por ejemplo:

el tinte de hematoxilina tiñe algunos componentes del núcleo de azul o violeta;

después del tratamiento secuencial con floroglucinol y luego con ácido clorhídrico, las membranas celulares lignificadas adquieren un color rojo cereza;

El tinte Sudán III tiñe de rosa las membranas celulares suberizadas;

una solución débil de yodo en yoduro de potasio vuelve azules los granos de almidón”.

Al realizar exámenes microscópicos, la mayoría de los tejidos se fijan antes de teñirlos.

Una vez fijadas, las células se vuelven permeables a los tintes y la estructura celular se estabiliza. Uno de los fijadores más habituales en botánica es el alcohol etílico.

Durante la preparación de la preparación para microcopia, se realizan secciones delgadas en un microtomo (Apéndice 1, Fig. 1). Este dispositivo utiliza el principio de la rebanadora de pan. Se hacen secciones ligeramente más gruesas para los tejidos vegetales que para los tejidos animales porque las células vegetales son relativamente más grandes. Espesor de las secciones de tejido vegetal para - 10 micrones - 20 micrones. Algunos tejidos son demasiado blandos para cortarlos de inmediato. Por lo tanto, después de la fijación, se vierten en parafina fundida o resina especial, que satura toda la tela. Después del enfriamiento, se forma un bloque sólido que luego se corta con un micrótomo. Esto se explica por el hecho de que las células vegetales tienen paredes celulares fuertes que forman la estructura del tejido. Las conchas lignificadas son especialmente duraderas.

Al utilizar el relleno durante la preparación, el corte corre el riesgo de dañar la estructura celular, para evitarlo utilice el método de congelación rápida. Al utilizar este método, puede prescindir de fijarlo y rellenarlo. El tejido congelado se corta con un microtomo especial: criotomo (Apéndice 1, Fig. 2).

Las secciones congeladas conservan mejor las características estructurales naturales. Sin embargo, son más difíciles de cocinar y la presencia de cristales de hielo arruina algunos de los detalles.

Los microscopios de contraste de fase (Apéndice 1, Fig. 3) y de interferencia (Apéndice 1, Fig. 4) le permiten examinar células vivas bajo un microscopio con una manifestación clara de los detalles de su estructura. Estos microscopios utilizan 2 haces de ondas de luz que interactúan (se superponen) entre sí, aumentando o disminuyendo la amplitud de las ondas que ingresan al ojo desde diferentes componentes de la célula.

La microscopía óptica tiene varias variedades.

Las propiedades del vidrio volumétrico para ampliar una imagen son familiares para la gente desde hace mucho tiempo. La lente más antigua encontrada por arqueólogos en Irak cerca de la ciudad de Nimrud data del siglo VIII a.C. Se desconocen los inventores de este útil dispositivo. Tampoco está claro quién lo utilizó por primera vez para crear un microscopio. Existe información confiable de que científicos famosos de los siglos XVI y XVII utilizaron combinaciones de dos lentes para sus instrumentos: Galileo Galilei, Girolamo Fracastoro, Christian Huygens. La historia no dice nada sobre si estos dispositivos se inventaron antes que ellos o no. Pero fue precisamente en esa época cuando se empezó a utilizar por primera vez la óptica para estudiar el micromundo.

Los investigadores rápidamente se dieron cuenta de que cuando se utilizan varias lentes a la vez, los poderes de aumento de los objetos no se suman, sino que se multiplican entre sí. Y esto da un efecto significativo, permitiéndole considerar objetos del micromundo. El problema fue que las primeras lentes eran imperfectas y bastante toscamente procesadas. Por lo tanto, la imagen se obtuvo con defectos que aumentaron junto con el objeto de estudio. Para solucionar este problema, se desarrollaron microscopios con una única lente potente, uno de los cuales permitió a Anthony Van Leeuwenhoek ver una célula vegetal. Sólo un siglo y medio después, los microscopios multicomponentes con varias lentes ganaron gran popularidad entre los científicos. Y con la llegada de la electricidad se empezó a utilizar la retroiluminación, lo que facilitó enormemente el proceso de observación. Así apareció un dispositivo similar en principio de funcionamiento a un microscopio óptico moderno.

Principio de funcionamiento

Un microscopio óptico utiliza una de las propiedades inherentes de un haz de luz: la refracción. Los rayos de iluminación se reflejan en el espejo, divergen del objeto y viajan en un haz paralelo dentro del tubo en el que están colocadas las lentes. Con la ayuda de lentes, los rayos se refractan, es decir. cambian el ángulo de su incidencia de tal manera que se concentran en la retina del ojo. De esta forma, el objeto de observación se amplía y aparecen sus detalles antes invisibles.

factor de ampliación

El ocular de un microscopio es la lente a la que mira directamente el ojo del observador. Normalmente, para estos fines se utilizan lentes de aumento de 10x. Debajo, en el tubo, hay varias lentes, cada una de las cuales tiene su propio aumento: 4, 10, 40 o 100. Dado que los aumentos se multiplican, dependiendo de la lente seleccionada en combinación con un ocular de diezx, Puede lograr una ampliación de 40 a 1000, respectivamente.

Normalmente, la observación comienza seleccionando una lente de 4x que proporcione el aumento más pequeño de 40x. ¿Para qué? El hecho es que para examinar un objeto en detalle, primero es necesario encontrarlo. Es inconveniente realizar dicha búsqueda con un aumento demasiado alto. Por lo tanto, al estudiar un objeto microscópico, por regla general, se comienza desde el aumento más pequeño hasta el más alto. Una lente con un aumento bajo le permite enfocar mucho más rápido que una lente con un aumento alto.

Aumento útil e inútil

La ampliación puede ser útil o inútil. ¿Cuál es la diferencia entre uno y otro? El caso es que las capacidades de cualquier microscopio óptico tienen un límite. Teóricamente es posible, utilizando muchas lentes, aumentar el aumento del dispositivo hasta el infinito.

Pero en la práctica existe un límite a partir del cual una mayor ampliación no permite ver nuevos detalles del objeto. Hasta este límite, el aumento se considera útil y después se considera inútil.

Resolución

No tiene sentido ampliar la imagen al infinito porque la resolución del dispositivo es finita. Esta habilidad es la distancia entre dos líneas cercanas, lo que te permite verlas por separado. Para un microscopio óptico, esta distancia alcanza un máximo de 0,2 µm. Es este factor, y no los valores finitos de aumento, el que limita el ámbito de aplicación de la microscopía óptica. Los objetos más pequeños son accesibles a los microscopios electrónicos y otros microscopios más modernos.

La lente es un cilindro (tubo) de metal en el que se montan varias lentes. Su aumento está indicado por números.

Para el ocular se utilizan dos o tres lentes. El objetivo del diafragma situado entre ellos es enfocar el campo de visión. La lente inferior enfoca los rayos que emanan del objeto y la observación en sí se produce con la ayuda de la superior.

El dispositivo de iluminación utiliza un espejo o una luz eléctrica. Un detalle importante es la presencia de un condensador, que incluye dos o tres lentes. Elevado o bajado sobre un soporte con un tornillo especial, puede concentrar o difundir la luz que incide sobre un objeto. El diámetro del chorro de luz se modifica mediante un diafragma especial controlado por una palanca. El grado de iluminación del objeto se regula mediante un anillo con vidrio esmerilado o un filtro de luz.

Componentes del sistema mecánico del microscopio:

• Pararse.
• Caja con dispositivos micrométricos.
• Tubo.
• Porta tubos.
• Tornillo de orientación grueso.
• Soporte y tornillo de movimiento del condensador.
• Revólver.
• Tabla de temas.

El objeto de observación se ubica en el escenario. Los mecanismos micrométricos están diseñados para pequeños movimientos del portatubos con tubo, de modo que la distancia entre la lente y el objeto sea óptima para la observación. Para un desplazamiento más significativo se utilizan tornillos de ajuste grueso. La función del revólver es cambiar rápidamente de lente. Se trata de un dispositivo extremadamente cómodo que los primeros microscopios no tenían, por lo que los evaluadores del pasado se vieron obligados a dedicar una enorme cantidad de tiempo y esfuerzo a este procedimiento. El soporte que sujeta el condensador también se puede subir y bajar mediante un tornillo.

Los objetos biológicos microscópicos suelen examinarse con un microscopio óptico. Fue con su ayuda que se descubrió la célula viva. Hoy en día, con la ayuda de un microscopio óptico es posible examinar una serie de orgánulos celulares que desempeñan un papel importante en el funcionamiento de un organismo vivo.

Este es el microscopio que se utiliza en la enseñanza de los cursos de biología escolares.

En particular, usando este dispositivo puedes ver:

• El núcleo, que es su componente principal.
• La pared que forma el aparato celular superficial, incluida la membrana.
• Los cloroplastos contienen clorofila, que es importante para las células vegetales, con la ayuda de la cual los hidrocarburos se convierten en agua y dióxido de carbono.
• Estructuras mitocondriales y complejo de Golgi, importantes para el metabolismo celular.

varios tipos de cilios, flagelos, vacuolas y orgánulos fotosensibles.

Los últimos logros: los microscopios más potentes

En 2006, un grupo de investigación dirigido por el científico alemán Stefan Hel y el argentino Mariano Bossi completó el desarrollo de un microscopio óptico (luz), que se convirtió en un verdadero avance en las tecnologías de investigación que utilizan óptica de alta precisión. El invento, llamado nanoscopio, permite observar objetos de menos de 10 nm. Esto produce imágenes de alta calidad en formato tridimensional. Probablemente este no sea el límite: continúan las investigaciones en diferentes países destinadas a aumentar la resolución del microscopio óptico.

Microscopio confocal e imágenes tomadas con su ayuda: grietas de anteras, vasos del xilema, cloroplastos en células del estigma.

microscopía óptica

Uno de los principales métodos de citología en la actualidad sigue siendo la microscopía, diseñada para estudiar la estructura de la célula, y se usa ampliamente en la investigación fundamental y aplicada. La invención del microscopio está asociada con los nombres de Galileo Galilei (italiano) y los hermanos Jansen (holandeses) en 1609-1611. El término "microscopio" fue acuñado por Faber (alemán) en 1625.

Actualmente, existen dos tipos principales de microscopía: óptica y electrónica. Las diferencias entre ellos radican en el principio de consideración del objeto. En el primer caso, el objeto se considera en el flujo de la parte visible de radiación electromagnética (longitud de onda = 400-750 nm), en el segundo caso, en el flujo de electrones. Estos dos métodos tienen resoluciones diferentes. La resolución o límite de resolución es la distancia mínima entre dos puntos en los que son visibles por separado. El límite de resolución del microscopio lo establece la longitud de onda del flujo de radiación en el que se estudia el objeto. Por lo tanto, la radiación de una longitud de onda determinada se puede utilizar para estudiar sólo aquellas estructuras cuyas dimensiones mínimas sean comparables a la longitud de onda de la radiación misma. El límite de resolución de la microscopía óptica lo alcanzaron los diseñadores de microscopios a finales del siglo XIX y era de 0,2 micrones. Esto significa que dos objetos, si están separados por menos de 0,2 micras, aparecerán como uno, incluso si ampliamos mucho la imagen, por ejemplo proyectándola en una pantalla. Por lo tanto, con la ayuda de un microscopio óptico no es posible examinar dos centriolos en el centro de la célula, parecen un solo punto (hay que decir que en los microscopios modernos producidos comercialmente no se alcanza la resolución máxima). Debido a la resolución limitada de un microscopio óptico, se puede utilizar para estudiar un número limitado de estructuras intracelulares, que incluyen: el núcleo, los plastidios, las vacuolas grandes y la pared celular vegetal. Los objetos más pequeños claramente visibles en un microscopio óptico son las bacterias y las mitocondrias, cuyo tamaño es de aproximadamente 500 nm (0,5 micrones), los objetos más pequeños no son claramente visibles, aumentando la precisión del procesamiento de la lente no se puede superar esta limitación, que está establecida por el Naturaleza ondulatoria de la luz.

La resolución depende no sólo de la longitud de onda de la fuente de luz, sino también del índice de refracción del medio a través del cual se observa el objeto, así como del ángulo en el que los rayos de luz entran en la lente. El conjunto estándar de lentes de microscopio consta de: lentes de bajo aumento (x8) con una apertura de A = 0,2 y lentes de alto aumento (x20) con A = 0,40 y - (x40) con A = 0,65. Estas lentes se denominan “secas”, ya que el objeto se ve a través del aire (índice de refracción n=1). Pero la mayoría de los microscopios también están equipados con objetivos de inmersión especiales, que requieren un entorno de inmersión especial (n=1). Un medio de este tipo puede ser agua; la lente x40 VI tiene una apertura de 0,75. El más común es la inmersión en aceite (n=1,51), a x90 el valor de apertura de la lente es A=1,25. Si se utiliza la inmersión, mejora la resolución del microscopio óptico. Sin embargo, las lentes de alta resolución tienen desventajas: poca profundidad de campo y bajo contraste.

El método más común de microscopía óptica es el método de campo claro, en el que los rayos de luz de un iluminador atraviesan el objeto y entran en la lente. De esta forma se estudian las células fijadas y teñidas. El descubrimiento de estructuras celulares básicas implica el desarrollo y uso de un conjunto de colorantes que tiñen selectivamente los componentes celulares y proporcionan contraste para su observación. Existe una gran variedad de tintes. Algunos de ellos se extraen de plantas y animales, todavía no existen análogos sintéticos. Por ejemplo, la hematoxilina, muy utilizada, es un extracto del palo de campeche tropical y el carmín es el pigmento de la grasa corporal de algunos tipos de pulgones. Todos estos son los llamados colorantes nucleares que colorean las estructuras que contienen ácidos nucleicos. El uso de un tinte no nuclear, el nitrato de plata, permitió a Camillo Golgi en 1898 observar y describir lo que más tarde se llamó aparato de Golgi.

Teñir una célula viva solo es posible en casos raros, por lo que se utilizan otros métodos para estudiarla. A diferencia del método de campo brillante, al observar objetos utilizando el método de campo oscuro, los rayos del iluminador no ingresan a la lente y la imagen se crea solo a partir de rayos dispersos provenientes del objeto. En este caso, sobre un fondo oscuro se pueden ver partículas luminosas de menor tamaño que la resolución de la lente, aunque el tamaño y la forma de las partículas son difíciles de determinar. La microscopía de campo oscuro con luz transmitida se utiliza para estudiar objetos transparentes normalmente invisibles en campo brillante y, especialmente, para observar células vivas. Las células vivas y moribundas se ven completamente diferentes sobre un fondo oscuro. El protoplasto de las células moribundas brilla más; no hay explicación para este hecho. Este método fue inventado por Zsigmondy (Austria) en 1912. En un microscopio óptico se pueden distinguir objetos que cambian la amplitud de los rayos de iluminación, pero las células vivas son transparentes a la luz visible y los rayos que atraviesan la célula prácticamente no lo hacen. cambiar la amplitud. El ojo humano no es capaz de percibir el cambio de fase de los rayos sin cambiar la amplitud. Por tanto, los métodos de contraste de fases (inventado por Zernike (holandés) en 1934) y microscopía de interferencia (inventada por Lebedev en 1932) se utilizan específicamente para estudiar células vivas. En tales sistemas, el paso de la luz a través de una célula viva va acompañado de un cambio en la fase de la onda luminosa. La luz se retrasa al atravesar zonas gruesas de la célula, como el núcleo. Se produce una recombinación de dos conjuntos de ondas, que crean una imagen de estructuras celulares.

Para estudiar objetos birrefringentes (granos de almidón, fibras vegetales, cristales), se utiliza la microscopía de polarización, cuyas bases fueron sentadas por Ebner en 1882. En este método se utiliza un dispositivo polarizador especial que convierte ondas de luz multidireccionales y adquirir una dirección.

En microscopía de fluorescencia, un objeto se ve a través de la luz que emite él mismo. El primer microscopio fluorescente fue diseñado por Keller y Zindentokf en 1908. Este método se basa en la capacidad de varias sustancias de brillar cuando se iluminan con rayos de longitud de onda corta (violeta o ultravioleta). La microscopía de fluorescencia se utiliza a menudo para identificar proteínas y anticuerpos específicos, y Koons fue el primero en utilizar fluorocromos para unirse a los anticuerpos, y esta reacción lleva su nombre. En los estudios citoembriológicos, este método se utiliza para estudiar estructuras que contienen el carbohidrato callosa. Para este método se utiliza un sistema óptico especial con una lámpara de mercurio conectada a un microscopio óptico.

Recientemente, las capacidades de la microscopía óptica han aumentado significativamente debido al uso de sistemas de video sensibles. La imagen creada por un microscopio óptico se procesa en una cámara de vídeo. Se limpia de "ruido", se convierte en señales digitales y se envía a una computadora, donde se somete a un procesamiento adicional para extraer información oculta. La microscopía de interferencia informática le permite lograr un alto contraste y analizar objetos transparentes y células vivas.

Microscopio de electrones

Los esfuerzos prolongados y continuos para mejorar los métodos de investigación produjeron los resultados deseados al final de la Segunda Guerra Mundial. Fue entonces, gracias a una asombrosa coincidencia de circunstancias, que casi al mismo tiempo los científicos se enriquecieron con una serie de nuevas y poderosas herramientas y métodos de investigación. En morfología, una herramienta de este tipo fue el microscopio electrónico. Creado en los años 30 del siglo XX, tenía suficiente resolución para penetrar en la célula, hasta estructuras de tamaño nanométrico. Al mismo tiempo, el haz de electrones tenía un poder de penetración débil, lo que requería la preparación de muestras muy finas del material y un alto vacío. Requisitos tan estrictos crearon serias dificultades, pero en un tiempo sorprendentemente corto fue posible desarrollar métodos para preparar muestras de tejido y construir dispositivos para obtener secciones delgadas de ellas. La calidad de los objetos mejoró constantemente y, a principios de la década de 1960, se habían descrito muchas estructuras celulares hasta entonces desconocidas.

Entonces, la resolución de un microscopio electrónico es mucho mayor que la de un microscopio óptico. Teóricamente, a un voltaje de 100.000 V, su resolución es de 0,002 nm, pero debido a la corrección de lentes electrónicas disminuye y en realidad es de 0,1 nm en los microscopios electrónicos modernos. Las importantes dificultades para observar objetos biológicos reducen aún más la resolución normal, que no supera los 2 nm. Sin embargo, este es 100 veces mayor que el de un microscopio óptico, por lo que la microscopía electrónica se llama ultramicroscópica.

El diseño general de un microscopio electrónico de transmisión se parece al de un microscopio óptico. Es significativamente más grande que el modelo liviano y parece estar al revés. La fuente de radiación en un microscopio electrónico es un filamento catódico que emite electrones (cañón de electrones). Los electrones se emiten desde lo alto de una columna cilíndrica de unos dos metros de altura. Para que no haya obstáculos al movimiento de los electrones, esto ocurre en el vacío, los electrones son acelerados por el ánodo y penetran a través de un pequeño orificio en la parte inferior de la columna con un estrecho haz de electrones. El haz de electrones se enfoca mediante anillos magnéticos a lo largo de la columna, que actúan como las lentes de vidrio de un microscopio óptico. La muestra se coloca en el camino del haz de electrones. En el momento de su paso por la muestra, parte de los electrones se dispersan de acuerdo con la densidad de la sustancia, el resto de electrones se enfocan formando una imagen en una placa fotográfica o en una pantalla.

El primer microscopio electrónico fue creado por Siemens en 1939. Permitió ver muchas estructuras sorprendentes en la célula. Pero para ello fue necesario inventar métodos completamente nuevos de preparación de fármacos, que comenzaron a utilizarse en 1952. Las células se fijan en este caso con glutaraldehído, que une covalentemente las proteínas, y luego con ácido ósmico, que estabiliza las capas de proteínas y lípidos. . La muestra se deshidrata y se impregna con resinas, que forman un bloque sólido después de la polimerización. Las secciones para microscopía electrónica deben tener aproximadamente 1:200 del espesor de una sola celda. Para realizar tales secciones se creó un ultramicrótomo (1953), que utiliza cuchillas de vidrio o diamante. Las secciones resultantes se colocan sobre una malla de cobre especial. La imagen del microscopio electrónico depende de la dispersión de electrones, que está determinada por el número atómico de la sustancia. Los objetos biológicos se componen principalmente de carbono, oxígeno e hidrógeno, que tienen un número atómico bajo. Para realzar el contraste, están impregnados de metales pesados ​​como osmio, uranio y plomo. Los cortes finos con microscopía electrónica de transmisión no permiten juzgar la estructura tridimensional de la célula; esta deficiencia se puede compensar con una serie de cortes a partir de los cuales se reconstruye la célula. Es un proceso largo.

También existe un método directo para estudiar la estructura tridimensional de objetos biológicos, la microscopía electrónica de barrido, creado en 1965. En este caso, los electrones se dispersan o emiten por la superficie del objeto, que debe fijarse, secarse y cubrirse. con una película de heavy metal, se utilizan para obtener una imagen. Este método sólo es aplicable para estudiar superficies y su resolución es baja, alrededor de 10 nm.

Microscopio electrónico

Microscopios electrónicos de transmisión, sonda y barrido. Imagen de microscopía electrónica de la superficie de una antera y un grano de polen.

Métodos químicos para estudiar células.

Un microscopio óptico clásico tiene una resolución baja, lo que no permite estudiar los detalles de la estructura de una célula de tamaño inferior a 0,25 micrones. La segunda etapa del estudio de la célula se remonta a la época en que los microscopistas trabajaban para mejorar sus instrumentos. Al mismo tiempo, finales del siglo XVIII. - El científico francés Antoine de Lavoisier y el inglés Joseph Priestley crean una nueva ciencia: la química. A diferencia de la morfología, que progresa de lo complejo a lo simple, la química progresa de lo simple a lo complejo. La química comenzó con la identificación de elementos, átomos y luego avanzó por el camino del estudio de algunas de sus combinaciones más simples: las moléculas.

La síntesis de la molécula biológica de urea, realizada por primera vez en 1828 por el científico alemán Friedrich Wöhler, ayudó a cruzar la frontera entre la química orgánica e inorgánica y permitió penetrar en el mundo viviente de la química. Esto marcó el comienzo del uso de un enfoque químico para el estudio de las células. Durante los siguientes cien años, se descubrieron, purificaron, estudiaron estructuralmente y sintetizaron aminoácidos, azúcares, grasas, purinas, pirimidinas y otras moléculas pequeñas. Los científicos pudieron hacerse una idea del metabolismo de estas sustancias en el organismo y de cómo se forman a partir de ellas las moléculas biológicas básicas: proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. Pero nuevamente surgieron obstáculos insuperables en el camino del progreso: la química clásica se mostró impotente ante las complejidades estructurales de estas grandes moléculas. Durante mucho tiempo, las células se estudiaban principalmente observándolas. Pero a medida que el método experimental se desarrolló en las ciencias naturales, comenzó a utilizarse en el estudio de los organismos vivos. Esto fue facilitado por poderosas investigaciones biomédicas llevadas a cabo en la segunda mitad del siglo XIX. A principios del siglo XX. El estadounidense Ross Garrison y el francés Alexis Carrel descubrieron que las células animales se pueden cultivar in vitro, de forma similar a como se hace con los organismos unicelulares. Así, demostraron la capacidad de las células para vivir de forma independiente y crearon un método de cultivo que ahora es uno de los más relevantes.

Pero todos estos métodos, esencialmente revolucionarios, eran todavía indirectos: la celda seguía siendo una caja negra cerrada. La enorme brecha entre la partícula más pequeña visible en un microscopio óptico y la molécula más grande accesible al estudio químico seguía siendo desconocida. En este espacio desconocido se escondieron conceptos y conceptos importantes, las funciones de las estructuras celulares descritas y su conexión con biomoléculas conocidas permanecieron desconocidas; sin todo esto, la vida de la célula seguía sin resolverse.

A su vez, la bioquímica también se ha enriquecido con una serie de dispositivos y métodos fundamentalmente nuevos. De particular interés fue la cromatografía, basada en un fenómeno muy simple: la formación de un borde o halo alrededor de una mancha (lo que vemos cuando intentamos eliminar una mancha con una solución especial). Este fenómeno se basa en las diferencias en la velocidad de movimiento de diferentes pinturas en el flujo del líquido que se esparce. A principios del siglo XX, el fisiólogo y bioquímico ruso Mikhail Semenovich Tsvet fue el primero en utilizar este fenómeno. Al pasar el extracto de las hojas a través de un tubo vertical lleno de un polvo adsorbente, pudo separar los principales pigmentos de las hojas (verde y naranja) y obtenerlos en forma de franjas o anillos de colores individuales a lo largo del tubo. Llamó a su método cromatografía (del griego khroma - color, grafeína - grabar). El color murió relativamente joven y el potencial de su método permaneció sin explotar hasta principios de los años 40. Actualmente existen muchas variaciones de la cromatografía, aplicables a todas las sustancias que pueden identificarse químicamente.

Cerca de la cromatografía se encuentra la electroforesis en gel, en la que no es el flujo de disolvente, sino la fuerza electromotriz la que promueve el movimiento y la separación de los componentes cargados eléctricamente. Estos métodos revolucionaron el campo del análisis químico. Ahora se pueden realizar análisis en trazas de una mezcla de casi cualquier composición.

El segundo método que cambió radicalmente el estudio químico de las células vivas fue el método de marcaje isotópico. Los isótopos son variedades de un mismo elemento químico que difieren en masa atómica. Algunos isótopos existen en la naturaleza, muchos pueden producirse artificialmente mediante reacciones nucleares. Los isótopos se utilizan para marcar específicamente ciertas moléculas de modo que dichas moléculas puedan distinguirse de las relacionadas sin alterar la estructura general. Este método se utiliza en el análisis de procesos biosintéticos que no podrían estudiarse de otra forma. Por ejemplo, con la producción de aminoácidos marcados, fue posible estudiar su combinación en proteínas en un organismo vivo o en condiciones experimentales, incluso a pesar de la cantidad ínfima de proteína recién formada, debido a su radiactividad. Este método se generalizó con la creación de reactores nucleares y la producción de una amplia gama de radioisótopos. Sin el método del átomo etiquetado, los avances en biología celular y molecular habrían sido imposibles.

Así, tanto la morfología como la bioquímica, enriquecidas con nuevos métodos, se mejoraron constantemente, la brecha entre sus conocimientos se hizo cada vez menor y desapareció por completo cuando fue posible dividir la célula en partes de tal manera que cada parte pudiera estudiarse de forma independiente.

Los métodos utilizados para dicho fraccionamiento se basan principalmente en la centrifugación. Este método utiliza diferencias en las propiedades físicas, en particular el tamaño y la densidad, de ciertos componentes de la célula para separarlos entre sí. Esto permitió estudiar gran parte de la célula y combinar conocimientos morfológicos y bioquímicos.

Sin embargo, una parte de la célula (su parte central crucial, el núcleo) permaneció en gran medida inaccesible hasta que ocurrió otro evento. Comenzó con un intento de analizar, utilizando la genética, las características de algunos virus simples que infectan a las bacterias y se denominan bacteriófagos o devoradores de bacterias. Esta investigación resultó ser el enfoque correcto para resolver el problema de la organización genética, que incluso en los organismos no celulares más simples era inusualmente complejo. Durante mucho tiempo, la nueva disciplina conocida hoy como biología molecular se limitó al estudio de virus y bacterias, pero luego irrumpió literalmente en la célula eucariota, permitiendo estudiar la regulación de la actividad celular.

Para estudiar las bases moleculares de la organización celular, se requiere un análisis bioquímico detallado. Requiere una cantidad importante de células de un determinado tipo, por lo que es imposible utilizar trozos de tejido, porque contienen células de diferentes tipos. En la primera etapa del trabajo, los trozos de tela se convierten en una suspensión. Esto se puede hacer destruyendo la sustancia intercelular y las conexiones intercelulares. Para ello, el tejido se trata con enzimas proteolíticas que destruyen las proteínas (tripsina, colagenasa). El calcio juega un papel importante en la conexión de las células y su adhesión, por lo que también se utilizan sustancias quelantes que se unen al calcio. Luego, los tejidos se someten a una suave destrucción mecánica y se separan en células individuales. La segunda etapa es la separación de la suspensión en fracciones separadas. Para ello, utilizan la centrifugación, con la que se separan las células grandes de las pequeñas y las ligeras de las pesadas, o se utilizan anticuerpos y la capacidad de las células para adherirse al vidrio o plástico con diferentes resistencias. La tercera etapa es la introducción de células aisladas en cultivo. Los primeros experimentos los llevó a cabo en 1907 Harrison, quien cultivó la médula espinal de anfibios en un coágulo de plasma. Los medios culturales tienen una composición bastante compleja. El medio estándar fue desarrollado a principios de los años 70 y contiene un conjunto de 13 aminoácidos, 8 vitaminas y sales minerales. Además, el medio puede incluir glucosa, penicilina, estreptomicina, suero de caballo o de ternera. Como demostraron Hayflick y Moorhead en 1961, la mayoría de las células de mamíferos mueren en cultivo después de un cierto número de divisiones. Las células de la piel humana se dividen en cultivo entre 50 y 100 veces. Sin embargo, a veces aparecen células mutantes en cultivo y pueden multiplicarse indefinidamente, formando una línea celular. En 1952, se aisló una línea celular continua de cáncer de cuello uterino conocida como línea HeLa. Estas líneas se almacenan a una temperatura de -70 C; después de descongelarlas, conservan la capacidad de dividirse. El método de cultivo de células vegetales se desarrolló en 1964. Con él, fue posible cultivar una planta de zanahoria entera in vitro a partir de células de raíz.

1. Todos los organismos vivos de la Tierra están formados por células similares en estructura, composición química y funcionamiento. Esto habla del parentesco (origen común) de todos los organismos vivos de la Tierra (la unidad del mundo orgánico).

2. La jaula es:

• unidad estructural (los organismos están formados por células)
• unidad funcional (las funciones corporales se realizan debido al trabajo de las células)
• unidad genética (la célula contiene información hereditaria)
• unidad de crecimiento (un organismo crece debido a la multiplicación de sus células)
• unidad de reproducción (la reproducción se produce debido a las células germinales)
• unidad de actividad vital (los procesos de metabolismo plástico y energético ocurren en la célula), etc.

3. Todas las nuevas células hijas se forman a partir de células madre existentes mediante división.

4. El crecimiento y desarrollo de un organismo multicelular se produce debido al crecimiento y reproducción (mediante mitosis) de una o más células originales.

Tipo

Gancho Abrió las celdas.

Leeuwenhoek células vivas descubiertas (espermatozoides, glóbulos rojos, ciliados, bacterias).

Marrón Abrió el núcleo.

Schleiden Y Schwann desarrolló la primera teoría celular (“Todos los organismos vivos en la Tierra están formados por células que son similares en estructura”).

Métodos

1. microscopio óptico aumenta hasta 2000 veces (escuela regular: de 100 a 500 veces). Son visibles el núcleo, los cloroplastos y la vacuola. Se pueden estudiar los procesos que ocurren en una célula viva (mitosis, movimiento de orgánulos, etc.).

2. microscopio electrónico aumenta hasta 10 7 veces, lo que permite estudiar la microestructura de los orgánulos. El método no funciona con objetos vivos.

3. Ultracentrífuga. Las células se destruyen y se colocan en una centrífuga. Los componentes celulares se separan según la densidad (las partes más pesadas se recogen en el fondo del tubo, las más ligeras en la superficie). El método permite el aislamiento selectivo y el estudio de orgánulos.

Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. Especifique la formulación de una de las disposiciones de la teoría celular.
1) La pared celular de los hongos está formada por carbohidratos.
2) Las células animales carecen de pared celular.
3) Las células de todos los organismos contienen un núcleo.
4) Las células de los organismos son similares en composición química.
5) Se forman nuevas células dividiendo la célula madre original.

Respuesta

Elija tres opciones. ¿Qué disposiciones contiene la teoría celular?
1) Se forman nuevas células como resultado de la división de la célula madre.
2) Las células sexuales contienen un conjunto haploide de cromosomas.
3) Las células son similares en composición química.
4) La célula es la unidad de desarrollo de todos los organismos.
5) Las células tisulares de todas las plantas y animales tienen la misma estructura.
6) Todas las células contienen moléculas de ADN.

Respuesta

1) migración biogénica de átomos
2) relación de organismos

4) la aparición de la vida en la Tierra hace unos 4.500 millones de años

6) relaciones entre la naturaleza viva y la inanimada

Respuesta

Elija una, la opción más correcta. ¿Qué método permite aislar y estudiar selectivamente orgánulos celulares?
1) colorear
2) centrifugación
3) microscopía
4) análisis químico

Respuesta

Elija una, la opción más correcta. Debido a que en cualquier célula se produce la nutrición, la respiración y la formación de productos de desecho, se considera una unidad.
1) crecimiento y desarrollo
2) funcional
3) genético
4) estructura del cuerpo

Respuesta

Elija tres opciones. Los principios básicos de la teoría celular nos permiten sacar conclusiones sobre
1) la influencia del medio ambiente en el fitness
2) relación de organismos
3) el origen de plantas y animales de un ancestro común
4) el desarrollo de organismos de simples a complejos
5) estructura similar de células de todos los organismos
6) la posibilidad de generación espontánea de vida a partir de materia inanimada

Respuesta

Elija tres opciones. Estructura similar de células vegetales y animales: prueba
1) su relación
2) el origen común de los organismos de todos los reinos
3) el origen de las plantas a partir de los animales.
4) complicaciones de los organismos en el proceso de evolución.
5) unidad del mundo orgánico
6) diversidad de organismos

Respuesta

Elija una, la opción más correcta. La célula es considerada la unidad de crecimiento y desarrollo de los organismos, ya que
1) tiene una estructura compleja
2) el cuerpo está formado por tejidos
3) el número de células aumenta en el cuerpo a través de la mitosis
4) los gametos participan en la reproducción sexual

Respuesta

Elija una, la opción más correcta. Una célula es una unidad de crecimiento y desarrollo de un organismo, ya que
1) tiene un núcleo
2) almacena información hereditaria
3) es capaz de dividirse
4) los tejidos están formados por células

Respuesta

1. Elija dos respuestas correctas de cinco y anote los números bajo los cuales se indican. Usando microscopía óptica en una célula vegetal se puede distinguir:
1) retículo endoplásmico
2) microtúbulos
3) vacuola
4) pared celular
5) ribosomas

Respuesta

2. Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. Se puede ver con un microscopio óptico.
1) división celular
2) replicación del ADN
3) transcripción
4) fotólisis del agua
5) cloroplastos

Respuesta

3. Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. Al estudiar una célula vegetal con un microscopio óptico, se puede ver
1) membrana celular y aparato de Golgi
2) membrana y citoplasma
3) núcleo y cloroplastos
4) ribosomas y mitocondrias
5) retículo endoplásmico y lisosomas

Respuesta

Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. Las siguientes personas contribuyeron al desarrollo de la teoría celular:
1) oparina
2) Vernadski
3) Schleiden y Schwann
4) Mendel
5) Virchow

Respuesta

Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. El método de centrifugación permite
1) determinar la composición cualitativa y cuantitativa de sustancias en la célula
2) determinar la configuración espacial y algunas propiedades físicas de las macromoléculas
3) purificar las macromoléculas extraídas de la célula
4) obtener una imagen tridimensional de la celda
5) dividir los orgánulos celulares

Respuesta

Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. ¿Cuál es la ventaja de utilizar la microscopía electrónica sobre la microscopía óptica?
1) mayor resolución
2) la capacidad de observar objetos vivos
3) el alto costo del método
4) la complejidad de preparar el medicamento
5) la capacidad de estudiar estructuras macromoleculares

Respuesta

Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números bajo los cuales se indican. ¿Qué orgánulos se descubrieron en la célula mediante un microscopio electrónico?
1) ribosomas
2) granos
3) cloroplastos
4) microtúbulos
5) vacuolas

Respuesta

Identifique dos características que “salen” de la lista general y escriba los números bajo los cuales se indican en su respuesta. Los principios básicos de la teoría celular nos permiten concluir que
1) migración biogénica de átomos
2) relación de organismos
3) el origen de plantas y animales de un ancestro común
4) la aparición de la vida en la Tierra hace unos 4.500 millones de años
5) estructura similar de células de todos los organismos

Respuesta

1. Seleccione dos respuestas correctas de cinco y anote los números bajo los cuales se indican en la tabla. Métodos utilizados en citología.
1) hibridológico
2) genealógico
3) centrifugación
4) microscopía
5) seguimiento

Respuesta

© D.V. Pozdnyakov, 2009-2019

Métodos de microscopía óptica y electrónica.

1. Microscopía óptica

interferencia del microscopio electrónico ligero

Un microscopio óptico puede aumentar el poder de resolución del ojo humano aproximadamente 1.000 veces. Ésta es la ampliación "útil" del microscopio. Cuando se utiliza la parte visible del espectro de luz, el límite máximo de resolución de un microscopio óptico es de 0,2 a 0,3 micrones. A continuación se analizarán los métodos de microscopía óptica.

1 Método de campo oscuro (ultramicroscopía)

El método del campo oscuro con luz transmitida se basa en el efecto Tyndall, ya que, al igual que las partículas de polvo de un haz de luz, cuando se iluminan desde un lado, brillan pequeñas partículas cuya luz reflejada ingresa a la lente del microscopio. La luz del iluminador y del espejo se dirige a la preparación mediante un condensador de campo oscuro. Al salir del condensador, la mayor parte de los rayos de luz, que no cambiaron de dirección al pasar a través de la preparación transparente, no entran en la lente. La imagen en el microscopio se forma utilizando sólo una pequeña parte de los rayos dispersados ​​por las micropartículas del fármaco en el portaobjetos. En el campo de visión sobre un fondo oscuro se ven imágenes claras de los elementos estructurales del fármaco, que se diferencian del entorno circundante por su índice de refracción. Las partículas grandes sólo tienen bordes brillantes que dispersan los rayos de luz.

El método de ultramicroscopía se basa en el mismo principio: las preparaciones en ultramicroscopios se iluminan perpendicularmente a la dirección de observación. Con este método se pueden detectar partículas extremadamente pequeñas, cuyo tamaño supera con creces el poder de resolución de los microscopios más potentes. Utilizando ultramicroscopios de inmersión es posible registrar la presencia de partículas de hasta 2 tamaños en una preparación. 10-9m. Pero la forma y las dimensiones exactas de estas partículas no se pueden determinar con este método. Los ultramicroscopios se utilizan principalmente en química de coloides.

2 Método de campo claro y sus variedades.

El método de campo claro con luz transmitida se utiliza para estudiar preparaciones transparentes que contienen partículas y detalles que absorben la luz. En ausencia del fármaco, un haz de luz del condensador, que pasa a través de la lente, produce un campo iluminado uniformemente cerca del plano focal del ocular. Si hay un elemento absorbente en la preparación, se produce una absorción parcial y una dispersión parcial de la luz que incide sobre él, lo que provoca la aparición de la imagen.

El método de iluminación oblicua es una variación del método anterior. La diferencia entre ellos es que la luz se dirige al objeto en un ángulo grande con respecto a la dirección de observación, esto ayuda a revelar el "alivio" del objeto debido a la formación de sombras.

El método del campo brillante con luz reflejada se utiliza para estudiar objetos opacos que reflejan la luz. La iluminación se produce desde arriba, a través de una lente que al mismo tiempo desempeña el papel de condensador. En la imagen creada en un plano por la lente junto con la lente tubular, se ve la estructura de la preparación debido a la diferencia en la reflectividad de sus elementos; En el campo brillante también destacan las heterogeneidades que dispersan la luz que incide sobre ellos.

1.3 Método de microscopía de contraste de fases.

La mayoría de las estructuras celulares difieren poco en el índice de refracción de la luz y la absorción de rayos entre sí y del medio ambiente. Para estudiar dichos componentes, es necesario cambiar la iluminación (con pérdida de claridad de la imagen) o utilizar métodos e instrumentos especiales. El método de microscopía de contraste de fases es uno de ellos. Es muy utilizado en el estudio vital de las células. La esencia del método es que incluso con diferencias muy pequeñas en los índices de refracción de diferentes elementos del fármaco, la onda de luz que los atraviesa sufre diferentes cambios de fase. Invisibles directamente para el ojo o para la placa fotográfica, estos cambios de fase se convierten mediante un dispositivo óptico especial en cambios en la amplitud de la onda luminosa, es decir, en cambios de brillo que ya son visibles al ojo o registrados en un dispositivo fotosensible. capa. En la imagen visible resultante, la distribución del brillo (amplitud) reproduce el relieve de fase. La imagen obtenida de esta forma se llama contraste de fase. Los objetos pueden aparecer oscuros sobre un fondo claro (contraste de fase positivo) o claros sobre un fondo oscuro (contraste de fase negativo).

4 Método de contraste de interferencia (microscopía de interferencia)

El método de contraste de interferencia es similar al anterior: ambos se basan en la interferencia de rayos que atraviesan una micropartícula y la atraviesan. Un haz de rayos de luz paralelos procedente del iluminador se bifurca en dos corrientes al entrar en el microscopio. Uno de los haces resultantes se dirige a través de la partícula observada y adquiere cambios en la fase de oscilación, el otro pasa por alto el objeto a lo largo de la misma rama óptica del microscopio o de otra adicional. En la parte ocular del microscopio, ambos haces se conectan nuevamente y se interfieren entre sí. Como resultado de la interferencia, se construirá una imagen en la que áreas de la celda con diferentes espesores o diferentes densidades se diferenciarán entre sí en el grado de contraste. El método de contraste de interferencia se utiliza a menudo junto con otros métodos de microscopía, en particular con la observación con luz polarizada. Su uso en combinación con la microscopía ultravioleta permite, por ejemplo, determinar el contenido de ácidos nucleicos en la masa seca total de un objeto.

5 Microscopía de polarización

La microscopía de polarización es un método para observar objetos que son isotrópicos, es decir, en luz polarizada. Orientación ordenada de partículas submicroscópicas. Delante del condensador de un microscopio polarizador se coloca un polarizador, que transmite ondas de luz con un plano de polarización específico. Después de la muestra y el objetivo, se coloca un analizador que pueda transmitir luz con el mismo plano de polarización. Si luego se gira el analizador 90° con respecto al primero, no pasará luz. En el caso de que entre estos prismas cruzados haya un objeto que tenga la capacidad de polarizar la luz, será visible brillando en un campo oscuro. Con un microscopio polarizador se puede comprobar, por ejemplo, la disposición orientada de las micelas en la pared celular de las plantas.

6 Estudio vital de las células

Las técnicas de microscopía óptica nos brindan la oportunidad de observar células vivas. Para la observación a corto plazo, las células generalmente se colocan en un medio líquido sobre un portaobjetos de vidrio. Pero durante más tiempo se necesitarán otros métodos. A menudo, se utilizan cámaras especiales para la observación a largo plazo (botellas planas con orificios cubiertos con vidrio fino o cámaras planas plegables). Las células se estudian en medios especialmente seleccionados para ellas. Habitualmente para los protozoos se trata de soluciones salinas equilibradas con la adición de microorganismos y otros protozoos que sirven de alimento al objeto de estudio. Las células libres de organismos multicelulares se pueden estudiar en plasma sanguíneo o en medios sintéticos especiales. Para estudiar células y tejidos animales se utiliza el método de cultivo celular.

El cultivo celular es un proceso mediante el cual células individuales in vitro (o una sola célula) se cultivan artificialmente en condiciones controladas para su posterior estudio. Una versión más sencilla de este método consiste en colocar un pequeño trozo de tejido vivo en una cámara con una solución nutritiva y, después de un tiempo, comienza el crecimiento y la división celular a lo largo de la periferia. La segunda forma de obtener un cultivo celular es tratar un trozo de tejido con tripsina o quelatón (lo que provocará la disociación celular) y luego colocarlo en un recipiente con un extracto nutritivo, donde, después de que las células se hundan hasta el fondo y adjuntar, la cultura comienza a crecer y multiplicarse. Para el cultivo celular, es preferible utilizar material embrionario, que tiene una mayor capacidad de dividirse que el material adulto. Al cultivar células se deben observar condiciones especiales de esterilidad, temperatura y pH. Se puede utilizar el mismo método para cultivar células de origen vegetal. Para ello, se tratan con enzimas que disuelven las membranas celulares y el contenido separado se coloca en un medio especial donde crecen y se dividen. Junto con el cultivo celular, se suelen utilizar el microcine y la microfotografía, con la ayuda de los cuales se registran muchos procesos celulares.

6.2 Método de microcirugía

El método de microcirugía se utiliza para estudiar células vivas. Este es un método de intervención quirúrgica e influencia en la célula, incl. eliminación o implantación de orgánulos individuales. Este método también implica el trasplante de orgánulos de una célula a otra y la introducción de grandes macromoléculas en la célula. Por lo general, el micromanipulador se combina con un microscopio, que se utiliza para controlar el progreso de la intervención quirúrgica. Los instrumentos microquirúrgicos son ganchos de vidrio, agujas y capilares fabricados en “microforjas”. Durante las microoperaciones, la célula se coloca en una cámara especial, en la que también se insertan los instrumentos. Recientemente, también se han utilizado ampliamente microhaces láser y microhaces UV. Se utilizan para atacar células durante la investigación.

6.3 Método de microscopía de fluorescencia

Un método para obtener una imagen ampliada utilizando el brillo de átomos y moléculas excitados de una muestra. En un microscopio de fluorescencia, la muestra se irradia con luz a una frecuencia más alta y la imagen se obtiene en el espectro óptico. La imagen del fármaco fluorescente se puede fotografiar con una cámara digital especializada que permite tomar imágenes de larga exposición. Muy a menudo se utilizan sustancias capaces de emitir fluorescencia o se inyectan agentes fluorescentes en la célula.

Un tipo de microscopía de fluorescencia es la microscopía confocal, una técnica que permite tomar imágenes desde cierta profundidad en el medio de una muestra.

1.6.4 Método de microscopía óptica de barrido confocal

Se utiliza un microscopio de barrido de luz confocal para obtener una reconstrucción tridimensional del objeto. Se utiliza para obtener una serie de secciones sucesivas de células tomadas de diferentes profundidades. Después de esto, un programa informático especial reúne estas imágenes y podemos obtener una imagen tridimensional del objeto.

7 Estudio de células fijas.

Se obtuvieron muchos datos sobre la estructura y el funcionamiento de las células utilizando células fijas. La fijación es un proceso complejo destinado a matar una célula, detener la actividad de las enzimas celulares, la descomposición de componentes, evitar la pérdida de estructuras y sustancias, así como su adquisición si estuvieran ausentes en una célula viva. Pero, lamentablemente, todavía no existe un pestillo que satisfaga todos estos requisitos.

7.1 Métodos de análisis citoquímico.

Se trata de una serie de técnicas de tinción cuyo objetivo principal es identificar sustancias químicas específicas en una célula. Existen varias técnicas de tinción que revelan directamente determinadas sustancias. Estas reacciones citoquímicas tienen requisitos: especificidad de unión del colorante, invariabilidad de la localización de la sustancia. Un ejemplo de tal reacción es la reacción de Feulgen al ADN.

7.2 Método citofotométrico

Este método le permite medir cuantitativamente el producto final de una reacción citoquímica. Se basa en determinar el número de sustancias por su absorción de luz de una determinada longitud de onda. La intensidad de la absorción de los rayos es proporcional a la concentración de la sustancia para el mismo espesor del objeto. Para este método, se utilizan microscopios-citofotómetros (detrás de sus lentes hay un fotómetro sensible). Este método se usa ampliamente para determinar la cantidad de ADN después de la reacción de Feulgen. También es posible cuantificar no sólo las sustancias que absorben luz, sino también las que la emiten. En esto se basa la fluorometría.

7.3 Método de investigación inmunoquímica (inmunoquímica reacciones usando anticuerpos fluorescentes)

El método tiene alta sensibilidad y especificidad. Existen métodos de inmunofluorescencia directa e indirecta, en el primer caso el antígeno se une a un anticuerpo conjugado con un marcador fluorescente (fluorocromo, por ejemplo, FITC o TRITC, en el segundo caso el antígeno se une a un anticuerpo específico no conjugado (anticuerpo primario) "La etiqueta fluorescente se conjuga con un anticuerpo secundario específico para el fragmento Fc del anticuerpo primario. El método indirecto es más sensible que el método directo. Mediante el brillo del fluorocromo, se encuentra la localización de las proteínas deseadas en la célula. Pero en orden Para que los anticuerpos marcados penetren en la célula, la membrana debe hacerse más permeable, lo que normalmente se consigue fijando las células y extrayendo parcialmente los lípidos de las membranas.

7.4 Método de autorradiografía

Este método se utiliza para detectar la localización de sitios de síntesis de biopolímeros, determinar las vías de transferencia de sustancias en la célula y monitorear la migración o las propiedades celulares. Para ello se utiliza el registro de sustancias marcadas con isótopos. El método repite el método de Becquerel. Junto con las células se introduce en el medio ambiente un precursor de una de las sustancias, en el que uno de los átomos es sustituido por un isótopo radiactivo. Durante el proceso de síntesis, el átomo marcado entrará en la propia molécula y podrá registrarse mediante una emulsión fotográfica. La precisión de este método depende del tamaño del grano de AgBr y de la energía de las partículas. Por lo tanto, para el método de autorradiografía se utiliza una emulsión fotográfica especial de grano fino e isótopos de baja energía. Los compuestos solubles en agua no pueden estudiarse mediante autorradiografía, ya que pueden perderse átomos.

7.5 Método de hibridación molecular

El uso del método anterior junto con el método de la autorradiografía nos brinda la oportunidad de localizar en los cromosomas lugares con una determinada secuencia de nucleótidos o incluso la ubicación de determinados genes. Para ello, se aplica una solución con ácido nucleico marcado a una preparación con ADN desnaturalizado como parte de cromosomas o núcleos. Durante el proceso de renaturalización del ADN, se forma un híbrido del ácido nucleico marcado y una región complementaria del ADN original. La ubicación de dicha conexión se registra autorradiográficamente. El método también se utiliza para teñir ácido nucleico con fluorocromos. Esto significa que podemos determinar la posición de cualquier secuencia de ADN.

Dado que la cuestión del aumento de la resolución siempre ha sido apremiante, los científicos han llegado a la conclusión de que en la microscopía óptica es posible aumentar la resolución sólo utilizando una fuente de luz que emita ondas con la longitud de onda más corta. Una fuente de este tipo podría ser un filamento caliente que emite una corriente de electrones, que puede enfocarse haciéndolo pasar a través de un campo magnético. A partir de esto se creó un microscopio óptico. Actualmente se distingue entre microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM). A continuación, se discutirán los métodos de microscopía electrónica.

1 Objetos corpusculares contrastantes

Hay varios métodos contrastantes. Veré dos de ellos: contraste negativo y sombreado metálico. El contraste negativo se realiza utilizando FVC, ácido de amonio-molibdeno y acetato de uranilo. Después de aplicar la solución al objeto en estudio, luego aplicarla a las películas del sustrato y secar, luego el objeto en estudio se sumergirá en una sustancia amorfa de alta densidad. Esto hará que en las fotografías aparezcan como objetos blancos sobre un fondo oscuro. Las soluciones también pueden penetrar profundamente en el objeto en estudio y revelar estructuras ocultas. También existe un método de contraste positivo. En este caso se utilizan sales de metales pesados, que aumentan la densidad electrónica del objeto, aumentando así su contraste. Sombreado con metales: durante la evaporación térmica de los metales, sus partículas se dispersan y se depositan sobre el objeto en estudio en forma de una capa, cuyo espesor varía según la dirección de vuelo de las partículas. En los lugares donde el haz de partículas está protegido, el espacio será más oscuro.

2.2 Ultramicrotomía

La ultramicrotomía es un conjunto de técnicas para la obtención de secciones ultrafinas mediante ultratomos o ultramicrotomos. Los ultramicrotomos son dispositivos para preparar automáticamente secciones de tejido ultrafinas de espesor programado (5-10 nm). Esto es necesario porque el haz de electrones, al atravesar objetos más gruesos, es absorbido, provocando calentamiento y provocando la deformación del fármaco. Su procedimiento es bastante similar al de la microscopía óptica. Las células se fijan primero, a menudo usando GA (glutaraldehído) y luego OsO. 4, aunque también se pueden utilizar por separado. Luego se realiza el cableado con la última etapa: inmersión en xileno. Luego la preparación se llena con resinas epoxi (Epon). Ahora el medicamento, encerrado en bloques sólidos, se puede cortar con cuchillos de vidrio o de diamante para producir secciones de tamaño tan pequeño que se aprovecha el suministro térmico del objeto. Luego se tiñe la preparación, normalmente con acetato de uranilo y nitrato de plomo, que contrastan positivamente. Esta técnica de fabricación ha abierto enormes posibilidades para la aplicación de la microscopía electrónica en casi todas las áreas de la biología y la medicina.

Es posible realizar investigaciones mediante autorradiografía utilizando emulsiones de grano ultrafino y grandes exposiciones. Así como estudios sin fijación y encapsulación en epon mediante crioultramicrotomía. En este caso, el objeto se congela instantáneamente a la temperatura del nitrógeno líquido, el agua pasa a un estado vítreo y los procesos se inhiben instantáneamente. Los cortes así obtenidos se utilizan en estudios inmunoquímicos, etc.

Para estudiar la estructura de los componentes de la membrana, se utiliza el método de escisión por congelación. El método es similar al anterior: el objeto se enfría instantáneamente a la temperatura del nitrógeno líquido y luego se corta con un cuchillo enfriado. La superficie de la capa se cubre con una capa de metal y carbono, luego se disuelve el objeto y se obtiene una réplica a partir de la superficie desconchada. En este caso, es posible estudiar el relieve superficial de las membranas.

3 Método de microscopía de alto voltaje.

El voltaje de aceleración de un microscopio de este tipo es de 1 a 3 millones de voltios. Este voltaje nos permite examinar objetos de mayor espesor (1-10 micras), y mediante imágenes estereoscópicas podemos obtener información sobre la organización 3D de las estructuras intracelulares con alta resolución.

4 Método de microscopía electrónica de barrido (rasterizada)

Cuando se utiliza este método, el objeto se cubre con una fina capa de metal evaporado, reflejada desde donde la sonda (haz de electrones) ingresa al dispositivo receptor, desde donde luego se transmite la señal. En este caso se obtiene una imagen casi tridimensional de la superficie del objeto en estudio, gracias a la gran profundidad de enfoque. También puede obtener información sobre la composición química de las células.

3. Microscopios ópticos y electrónicos.

1 La estructura de un microscopio óptico y sus principales características.

Para comprender el principio de funcionamiento de un microscopio óptico, es necesario considerar su estructura.

El principal dispositivo biológico es un sistema óptico que consta de un trípode, iluminación y piezas ópticas. El trípode incluye una zapata; un escenario con un soporte para diapositivas y dos tornillos que mueven el escenario en dos direcciones perpendiculares; tubo, soporte para tubo; macro y microtornillos que mueven el tubo en dirección vertical.

Para iluminar un objeto se utiliza iluminación natural difusa o artificial, la cual se realiza mediante un microscopio montado permanentemente en el zapato o conectado a través de una barra iluminadora.

El sistema de iluminación también incluye un espejo de superficies planas y cóncavas y un condensador ubicado debajo del escenario y compuesto por 2 lentes, un diafragma iris y un marco plegable para filtros. La parte óptica incluye juegos de lentes y oculares que permiten estudiar las células con diferentes aumentos.

El principio de funcionamiento de un microscopio óptico es que un haz de luz de una fuente de luz se recoge en un condensador y se dirige hacia un objeto. Al atravesarlo, los rayos de luz ingresan al sistema de lentes de la lente. Crean una imagen primaria, que se amplía mediante las lentes del ocular. En general, la lente y el ocular proporcionan una imagen virtual y ampliada inversa del objeto.

Las principales características de cualquier microscopio son la resolución y el contraste.

La resolución es la distancia mínima a la que se ubican dos puntos, demostrada por separado por el microscopio.

,

Dónde λ - longitud de onda de la luz del iluminador,

α - el ángulo entre el eje óptico de la lente y el rayo más desviado que entra en ella es el índice de refracción del medio.

Cuanto más corta sea la longitud de onda del haz, más detalles más finos podremos observar a través del microscopio. Y cuanto mayor sea la apertura numérica de la lente (n , mayor será la resolución de la lente.

Un microscopio óptico puede aumentar el poder de resolución del ojo humano aproximadamente 1.000 veces. Ésta es la ampliación "útil" del microscopio. Cuando se utiliza la parte visible del espectro de luz, el límite máximo de resolución de un microscopio óptico es de 0,2 a 0,3 micrones.

Sin embargo, cabe destacar que la microscopía óptica nos permite ver partículas más pequeñas que el límite de resolución. Esto se puede hacer utilizando el método de "campo oscuro" o "ultramicroscopía".

Arroz. 1 microscopio óptico: 1 - trípode; 2 - tabla de objetos; 3 - boquilla; 4 - ocular; 5 - tubo; 6 - cambiador de lentes; 7 - microlentes; 8 - condensador; 9 - mecanismo para mover el condensador; 10 - coleccionista; 11 - sistema de iluminación; 12 - mecanismo de enfoque del microscopio.

2 Estructura de un microscopio electrónico

La parte principal del microscopio electrónico es un cilindro hueco de vacío (el aire se evacua para evitar la interacción de los electrones con sus componentes y la oxidación del filamento del cátodo). Se aplica un alto voltaje entre el cátodo y el ánodo para acelerar aún más los electrones. En una lente de condensador (que es un electroimán, como todas las lentes de los microscopios electrónicos), se enfoca un haz de electrones que incide sobre el objeto que se está estudiando. Los electrones transmitidos forman una imagen primaria ampliada en la lente del objetivo, que es magnificada por la lente de proyección y proyectada en la pantalla, que está cubierta con una capa luminiscente para brillar cuando los electrones la golpean.

Arroz. 2. Microscopio electrónico: 1 - cañón de electrones; 2 - ánodo; 3 - bobina para ajustar la pistola; 4 - válvula de pistola; 5 - 1.ª lente del condensador; 6 - 2.ª lente del condensador; 7 - bobina para inclinar la viga 8 - condensador 2 diafragmas; 9 - lente objetivo; 10 - bloque de muestra; 11 - diafragma de difracción; 12 - lente de difracción; 13 - lente intermedia; 14 - 1.ª lente de proyección; 15 - 2.ª lente de proyección; 16 - binocular (aumento 12); 17 - bloque de vacío de la columna; 18 - cámara para carrete de película de 35 mm; 19 - pantalla para enfocar; 20 - cámara para registros; 21 - pantalla principal; 22 - bomba de sorción de iones.

Bibliografía

Literatura educativa

.Yu.S. Chentsov, Introducción a la biología celular, edición 4

sitios de Internet

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