Вестерн блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting). Основы вестерн-блоттинга Вестерн блоттинг ошибки при выполнении

Вестерн блоттинг

Профессор кафедры биохимии
и молекулярной биологии,
Д.м.н. Спирина Людмила
Викторовна
Вестерн блоттинг

Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,

аналитический
метод,
используемый для
определения
специфичных
белков в образце.

Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting)

Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,
белковый иммуноблот, Western bloting)
Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории
Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)
Название вестерн-блот было дано технике У.
Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от
названия Саузерн Блоттинг (Southern blotting). методики определения ДНК, разработанной
ранее Эдвином Саузерном

Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)

Western Blotting –
метод определения
белков
Саузерн блоттингметодики
определения ДНК,
разработанной
ранее Эдвином
Саузерном Southern
blotting).
Аналогичный метод
определения РНК
называется Нозерн
Блоттинг (Nothern
blotting).
Детекция
посттрансляционных
модификаций белков
называется Истерн
Блоттингом (Eastern
blotting).

протокол. ПРОТОКОЛ

ПРОТОКОЛ
1. Разделение белков
методом SDS-PAGE гельэлектрофореза/
С помощью гель-электрофореза
белки разделяются в
полиакриламидном геле.
2. Перенос белков на
мембрану
3. Блокирование и Детекция
Затем их детектируют с
использованием антител:
сначала белки связываются с
первичными (моно- или
поликлональными) антителами,
которые в свою очередь
связываются
со вторичными антителами,
конъюгированными с ферментами
(пероксидазой хрена или
щелочной фосфатазой).

протокол. Вестерн-блоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг.

протокол.
Вестерн-блоттингом можно обнаруживать
антиген в количествах менее 1нг.
4. Визуализация.
Высокая степень
разрешения достигается за
счет электрофоретического
разделения белков и
специфичности
моноклональных антител.
Визуализация
исследуемого белка
достигается путем
проведения
соответствующей
биохимической реакции с
образованием продукта,
который определяется
колориметрическим,хемилюминесцентным,
флюоресцентным методами
детекции.

5. Анализ.

Количество белка оценивается с
помощью денситометрии.

Southern Blotting Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть геном

Геномную ДНК (обычно
выделенную из
лейкоцитов или клеток
плода) расщепляют на
короткие фрагменты,
разделяют их в агарозном
геле, переносят на
мембрану, после чего
идентифицируют
специфические участки с
помощью гибридизации с
олигонуклеотидными
зондами.

Nothern Blotting

Аналог Southern Blotting.
Этот метод позволяет выявить специфическую
мРНК и оценить ее размер.

Eastern Blotting (является продолжением метода Вестерн блоттинг)

Определение метода Вестерн Блоттинг

Метод основан на
комбинации гельэлектрофореза и
иммунохимической
реакции «антигенантитело».

«Твердая фаза» для иммуноблота

пористые материалы типа
нитроцеллюлозы (PVDF) в виде
наполнителей в объеме или в виде
плоских листов или полосок стрипов
(англ. strip); стрипы используют в
методиках типа иммуноблота и
иммунохроматографии;
в пористых материалах существенно
больше площадь, на которой
сорбирован один из участников
взаимодействия; другие реагенты
диффундируют по порам.

Типы твердой фазы для Вестерн блоттинга

Подготовка образца

Образец может быть взят из цельной
ткани или из клеточной культуры. В Цельная ткань
Клеточная культура
большинстве случаев, твёрдые ткани
сначала измельчаются механически
с использованием блендера (для
образцов большого объёма), с
Механическое измельчение
использованием гомогенизатора
(меньшие объемы), или
обработки ультразвуком.
Различные детергенты детергенты,Измельчение гомогенизатором
соли и буферы могут быть
применены для
улучшения лизиса клеток и
растворения белков.
Обработка ультразвуком
Ингибиторы протеаз и фосфатаз част
о добавляются для предотвращения
расщепления образцов их
Измельчение в жидком азоте
собственными ферментами.
Подготовка тканей часто
выполняется при низких
температурах, чтобы
Ингибиторы протеаз, фосфатаз
избежать денатурации белка.
Условия, улучшающие
пробоподготовку
Детергенты, соли, буферы
производит гомогенизацию образцов за счет их встряхивания
в микропробирках или чашах вместе с твердыми шариками
Низкие температуры

Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез. Наиболее
распространенный способ
разделения белков -
электрофорез в
полиакриламидном геле в
присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез
SDS вызывает
денатурацию белков
и поддерживает их в
денатурированном
состоянии, для
разрушения
вторичных и
третичных структур
белков используют
восстановители
дисульфидных
связей

Гель -электрофорез

Подлежащие
анализу белки в
присутствии
додецилсульфата
натрия приобретают
одинаковый
отрицательный
заряд, что делает
возможным их
разделение в
зависимости только
от молекулярной

Принцип электрофореза

Предварительно
денатурированные белки
вносят в карманы «треков»
(дорожек) акриламидного геля
с низкой концентрацией
(концентрирующий гель), что
позволяет их сконцентрировать
перед переходом в
разделяющий гель (с более
высокой концентрацией), где
происходит разделение белков
в зависимости от молекулярной
массы.
Белки мигрируют в
электрическом поле через
акриламидный гель к аноду,
при этом белки меньшего
размера двигаются быстрее.

Принцип электрофореза

Отличия в скорости
продвижения -
электрофоретической
подвижности приводит к
разделению белков на полосы.
Как правило, одну из
«дорожек» оставляют для
маркеров молекулярной массы
(смеси белков с известными
массами).

Окрашивание гелей

окрашивание белков в
гелях красителем
Кумасси
окрашивание белков в
гелях серебром
Для визуализации результатов электрофореза чаще
всего используют окрашивание белков в гелях
красителем Кумасси или серебром

В большинстве случаев результаты
электрофоретического разделения достаточно
получить путем визуальной оценки геля.
Однако, с целью получения достоверных данных и
надлежащего документирования результатов гель
сканируют на просвет при помощи высокочувствительного
денситометра, что позволяет надежно определять не
только положение белков в геле, но и оптическую
плотность белкового пятна.
Окрашивание
мембраны более
надежно

Анализ электрофоретического разделения белков, Блоттинг

С помощью специального программного приложения
можно определить такие параметры как
электрофоретическая подвижность белка, его
чистота, количество белка в пятне и др.
Чаще используют хемилюминесцентную систему
детекции белков – использование рентгеновских пленок
(Блоттинг)
Используют
программное
приложение ImageJ

Применение системы визуализации для WB (см. ниже)

Анализ электрофоретического разделения белков

Определение молекулярной массы исследуемого белка
предполагает необходимость калибровки геля по
молекулярным массам. Калибруют гель относительно
молекулярных масс белков-маркеров, которые
разделяют параллельно с исследуемым образцом.

Выбор % разрешающего геля.

концентрация
акриламида определяет
разрешающую
способность геля - чем
выше концентрация
акриламида, тем лучше
разделение
низкомолекулярных
белков. Низкая
концентрация
акриламида улучшает
разрешающую
способность гельэлектрофореза для
высокомолекулярных
Размер белка, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изг

Перенос на мембрану
Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской
геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или PVDF.
Мембрана накладывается поверх геля,
а поверх неё кладут стопку
фильтровальной бумаги.
Метод переноса белков
называется электроблоттингом и
использует электрический ток, который
переносит белки из геля на мембрану.
Белки перемещаются из геля на
мембрану с сохранением своего
расположения. В результате этого
«промакивания» (blotting) процесса
белки удерживаются на тонком
поверхностном слое мембраны для
детекции.
Оба варианта мембран используют изза их свойства неспецифично связывать
белки.
Связывание белков основано как
на гидрофобных взаимодействиях, так
и на электростатических
взаимодействиях между мембраной и
белком.
Нитроцеллюлозная мембрана дешевле
PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже
выдерживает повторное нанесение
меток.

Виды электроблоттинга

Сухой
Влажный
Полусухой
(semidry)

Окрашивание белков на фильтре

Способ
окраски
Ponceau S
Чувствительность,
количество
белка
1-2µg
Нитроцеллюлоза
+
Нейлон
-
PVDF
+
Amido
Black
1.5µg
+
-
+
Comassie
blue
1.5µg
+
-
+
India ink
100ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Colloidal
gold
3ng
+
-
+
Окрашивание
обратимое
постоянное, низкий фон
постоянное, высокий фон
постоянное
постоянное, бледнеет со
временем
постоянное

Подтверждение переноса белков на фильтр (окраска Ponceus)

Блокирование

Как только выбрана
мембрана, выбраны антитела
и целевой белок, должны
быть приняты меры по
исключению взаимодействия
между мембраной и
антителом, используемым для
детекции целевого белка (ибо
антитело само по себе белок).
Блокирование
неспецифичных связываний
достигается помещением
мембраны в разбавленный
раствор белка - обычно это
бычий сывороточный
альбумин или нежирное
сухое молоко или желатин
с небольшим процентом
детергента типа Tween-20.
Блокирование – один из
важных этапов
проведения
эффективного Вестерн
блоттинга

Механизм блокирования

Белок
из разбавленного
раствора прикрепляется к
мембране во всех местах,
где не прикрепился целевой
белок. Поэтому, при
добавлении антител, им
(антителам) нет свободного
места на мембране, куда бы
они могли прикрепиться,
кроме сайтов связывания на
специфичных целевых
белках. Этот фоновый
«шум» в окончательном
продукте вестерн блота
приводит к чистым
результатам и
исключению ложно-

Детекция. Непрямой и прямой WB

преимущества
Вторичное антитело усиливает сигнал (несколько вторичных
антител могут связываться с одним первичным)
Имеется широкий выбор вторичных антител
Одно вторичное антитела может быть использовано для
детекции различных специфичных антител
связывание с ферментативной меткой вторичного антитела не
влияет на иммунореактивность первичного антитела
Замена вторичного антитела может способствовать изменению
метода детекции
недостатки
Вторичные антитела способствуют образованию сайтов
неспецифичного связывания
Дополнительные этапы работы
преимущества
необходимость использовать только
первичные антитела, что ускоряет процесс
возможность использовать первичные
антитела с разными метками
Недостатки
связывание с ферментативной меткой
может снижать иммунореактивность
первичного антитела
высокая стоимость первичных антител
проблема выбора антитела и низкий
сигнал

Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим антителом (первичным).

Раствор антител и мембрана
могут быть вместе закрыты и
инкубированы от 30 минут
до оставления на ночь.
Также они могут быть
инкубированы при
различных температурах,
при повышенной
температуре наблюдается
лучшее связывание.
После удаления
несвязавшихся первичных
антител, мембрану
выдерживают со вторичными
антителами и в соответствии
с их целевыми свойствами,
как правило называются по

Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции.

Антитела получают из
животного источника и
связываются с
большинством первичных
антител. Вторичные
антитела обычно связывают
щелочной фосфатазой или
пероксидазой хрена.
Наиболее
распространенные,
связанные с пероксидазой
хрена вторичные антитела
используются для
разрезания
хемилюминесцентного
агента, и продукт реакции
производит люминесцентное
излучение пропорционально
количеству белка.
Лист светочувствительной
фотографической пленки
помещается напротив мембраны
и подвергается действию
излучения реакции, создавая
изображение полос антител на
блоте.
Более дешевый, но менее
чувствительный подход с
использованием 4хлорнафтольного окрашивания
в смеси с 1 % перекисью
водорода, что дает темнокоричневое окрашивание,
которое регистрируется без
использования специальной
фотографической пленки.

Другой метод детекции
вторичными антителами
использует антитела со
связанным флюорофором,
который излучает в
ближней инфракрасной
области (NIR). Свет,
излучаемый
флюоресцентным
красителем, постоянен и
делает флюоресцентную
детекцию более точным и
чувствительным способом
измерения разницы в
сигнале, производимом
белками, которые мечены
антителами, на вестерн
блоте.

Детекция. Другие методы детекции.

Третий альтернативный
метод использует
радиоактивную метку
вместо фермента,
связанного с вторичным
антителом (с
радиоактивным изотопом
йода). Другие методы
безопаснее, быстрее и
дешевле, поэтому
радиоактивная детекция
используется редко.

Визуализация.

Визуализация
осуществляется с
помощью гельдокументирующих
систем или цифровой
камерой.

Представление фильма

Stain free technology

На практике, не во всех
вестернах обнаруживают
белки лишь по одному бэнду
на мембране.
Приблизительный размер
вычисляют сравнивая
окрашенные бэнды с
маркерами молекулярной
массы, добавленными при
электрофорезе.
Процесс повторят с
структурными белками,
такими как актин или
тубулин, которые не
меняют между
экспериментами. Количество
целевого белка зависит от
количества контрольного
структурного белка между
группами. Этот прием
обеспечивает коррекцию
количества общего белка на
мембране в случае ошибки

Анализ и представление результатов.

Использование
программного
приложения Image
J.
Программного
приложение BioRad

ИГХ
Иммунная
флюоресценция
Вестерн
блоттинг

Применение метода

Вестерн-блоттинг
используется
в молекулярной
биологии, биохимии, гене
тике и в других
естественно-научных
дисциплинах.
В медицине:
диагностика ВИЧ
(СПИД), болезнь
лайма,Helicobacter
Pylori, вирус ЭпштейнБарр

Полный протокол

1. электрофорез
2. перенос
3. блокирование
4. инкубация с
первичным антителом
5.отмывка
6.инкубация со
вторичным антителом
7. отмывка
8. обработка
хемилюминесцентной
системой детекции
9. детекция с помощью
рентгеновской пленки
10. анализ

Применение в практической медицине

Подтверждение
инфицированности ВИЧ
Диагностика клещевого
боррелиоза (болезнь Лайма)
Диагностика сибирской язвы
Диагностика токсоплазмоза
(Т);
группу инфекций –
гепатиты, сифилис,
хламидиоз, листериоз и др.
(О);
краснуху (R);
цитомегаловирусную
инфекцию (С);
герпес (Н).
Вирус Эпштейн-Барр
В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены
только
клинически
значимые
антигены
(нативные,
синтетические или рекомбинантные) в определенном
порядке. Такой подход используют для дифференциальной
диагностики нескольких инфекций на одном стрипе

Вестерн-блоттинг — метод, который заключается в поиске специфических антител против бактерий, вызывающих болезнь Лайма. Что такое тест Вестерн-блот? Как интерпретировать результаты исследования?

Вестерн-блоттинг — это тест, который ищет антитела, которые организм вырабатывает против бактерий, вызывающих болезнь Лайма. На поверхности бактерий существуют антигены, против которых организм имеет специфические антитела в классе IgM и IgG. IgM.

Иммуноглобулины M (IgM) — производятся, когда наш организм впервые встречает данный патоген. Увеличение количества IgM против данного патогена указывает на начало процесса заболевания.

Иммуноглобулины G (IgG) продуцируются организмом после IgM, самый высокий уровень достигается около полугода после заражения, и в отличие от IgM антитела могут сохраняться в крови в течение очень долгого времени, даже нескольких лет.

Тест Вестерн-Блот — показания для проведения

Вестерн-блот используется во втором этапе диагностики боррелиоза — когда тест ELISA (первый тест) дал положительный или сомнительный результат. Однако он не используется, когда тест ELISA дал однозначно отрицательный результат.

Вестерн-блоттинг — в чём заключается тест?

Тест Вестерн-Блот на боррелиоз (болезнь Лайма) точно оценивает антитела к различным фрагментам бактерий. Различные антитела
против отдельных бактериальных фрагментов графически отражены как черные полосы на нитроцеллюлозной бумаге.

1. Для проведения теста необходимы два основных элемента: сыворотка крови пациента и убитые и фрагментированные культивируемые бактерии боррелиоза.

Не делайте этот теста вскоре после укуса клеща. Подождите минимум 4 недели. Стоимость исследования методом Вестерн-Блоттинг в обоих классах антител составляет около 2500-5000 рублей.

2. Под воздействием электрического тока происходит распределение на факторы, в первую очередь бактерий, полученной из культуры клеток, в том числе на бактериальные белки (антигены). Затем эти белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрана разрезается на полоски.

3. Полоска с антигенами, в сочетании с сывороткой крови пациента, окрашивается с использованием специальной методики, которая обнаруживает антитела, специфически связанные с антигенами Sprechete Borrelia.

4. В местах, где антитела пациента связаны с белками (антигенами) бактерий боррелиоза, мы замечаем характерные полосы (что указывает на инфекцию бактериями Лайма). Результат теста положительный.

Каждая полоса соответствует бактериальному белку (антиген). Если белки клеток Боррелиоза и антитела не соединяются, полоса не появится. Тогда результат отрицательный.

Тест Вестерн-Блот — когда надо делать?

Ранняя диагностика болезни Лайма проблематична из-за так называемого серологического окна. Это период от начала инфицирования до старта продуцирующего детектируемых антител организмом. В случае болезни Лайма серологическое окно длится в среднем 4 недели.

Выполнение тестов менее чем за 4 недели после укуса клещей создает риск получения ложноотрицательного результата.

Тест Вестерн-Блот — положительный результат

Наличие антител против Боррелий означает, что у вас болезнь Лайма. Однако трудно ответить на вопрос, активна ли инфекция или нет.

IgG-антитела, полученные в результате инфекции, можно обнаружить в крови даже через 10, а иногда через 20 лет после диагноза болезни Лайма.

Также случается, что обнаруженные антитела класса IgM (обычно считающиеся активным маркером инфекции) могут быть постоянными и также не указывают на активную инфекцию.

Тест Вестерн-Блот — отрицательный результат

Тест может дать отрицательный результат в начальный период заболевания, т.е. В первые несколько недель после укуса.

Вестерн-блоттинг может быть выполнен не только при подозрении Лайма, но также при заражении H. pylori (который вызывает язвенную болезнь) или ВИЧ.

Тест Вестерн-блот может дать ложно отрицательный результат и в другой ситуации — когда в старом хроническом боррелиозе производство антител было остановлено или когда антитела были полностью использованы в борьбе с этим заболеванием.

Если подозрение на болезнь Лайма сильное, исследование Вестерн-Блот стоит несколько раз повторять, например, каждые несколько недель, чтобы попасть на такой момент, когда антитела присутствуют в крови.

Наличие антител в активной болезни Лайма варьируется, и у человека с отрицательным результатом есть шанс получить положительный результат при повтороном тесте через несколько недель. Иногда подтверждение диагноза получают только после четвертого или пятого раза.

В этом случае некоторые врачи пытаются получить подтверждение инфекции по-другому: они лечат пациента антибиотиками в течение нескольких недель и через 5-6 недель они направляют его на Вестерн-блоттинг.

Лечение антибиотиками в течение такого времени не может излечить хроническое заболевание, но оно настолько изменяет иммунную систему, что в крови будет достаточно антител, чтобы их можно было обнаружить. Результат Вестерн-блот теста должен интерпретироваться врачом, который специализируется на лечении болезни Лайма

Тест ВБ может проводиться и во время антибактериальной терапии, но с антибиотиками вероятность положительного результата несколько меньше. Самый простой способ диагностировать болезнь с этим тестом — через 6 недель после прекращения терапии антибиотиками.

Важно

Интерпретация исследования — это интерпретация полос. Как правило, следует полагать, что чем больше полос, тем надежнее диагноз. Три полоски это уже действительно большая уверенность, а 5-6 полос — болезнь Лайма с практически 100% вероятностью.

Полосы IgM имеют большее диагностическое значение, поскольку они предполагают активную фазу клещевого боррелиоза, хотя обнаруженные антитела в IgM-классе (полосы IgM) могут быть постоянными и не указывать на активную инфекцию. Оказывается потому, что IgM высок в начале инфекции и, вопреки логике, при хронической болезни Лайма.

Повышенные уровни антител в классе IgG можно рассматривать как остаточную инфекцию, или это означает хроническое активное заболевание.

Даже отрицательный результат теста не означает, что болезнь Лайма отсутствует. Отрицательный результат теста означает только, что в крови нет антител против бактерий боррелиоза — это может иметь место, например, когда бактерии вошли в организм, а производство антител еще не началось (врачи называют этот период серологическим окном).

Из-за множества методов проведения этого исследования трудно сделать универсальные рекомендации относительно интерпретации. Каждая лаборатория использует свои критерии.

Болезнь может быть обнаружена только врачом-специалистом на основании симптомов и результатов лабораторных испытаний. Тест Вестер-Блот нельзя интерпретировать без учёта симптомов.

Скачать методичку

Суть метода. Вестерн-блоттинг (иммуноблотинг, от англ. Blotting — промокание) - современный высокочувствительный аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с помощью антител.

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген/антитело (исследуемый белок)». Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моно- или поликлональных антител. В оптимально подобранных условиях Вестерн-блоттингом можно обнаружить белок в количестве менее 1 нг.

Этапы Вестерн-блоттинга:

Разделение белков методом SDS-электрофореза. Наиболее распространенным способом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле, в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS ). В присутствии SDS белки подлежащие анализу приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы. Денатурированные белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее. Так же на гель наносят маркеры (смесь белков с известными молекулярными массами). Отличия в скорости продвижения (электрофоретической подвижности) приводит к разделению белков на полосы.
Перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF ) происходит под действием электрического тока. В результате этого процесса белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны, где за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий происходит их связывание с мембраной. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
Блокирование. Для того, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с мембраной, последнюю инкубируют в разбавленном растворе белка - обычно используют бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко. Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех местах, где нет белковых полос. В результате антитела при их добавлении могут связываться только со специфичными сайтами связывания исследуемых белков. Блокирование позволяет достичь чистого фона и исключить получение ложноположительных результатов.
Связывание исследуемого белка с антителами. После блокирования мембраны ее отмывают буфером (3 раза) и последовательно инкубируют с различными антителами методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые, в свою очередь, связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
Детекция. Визуализации исследуемого белка достигают путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяют колориметрическим, хемилюминесцентным или флюоресцентным методами детекции. Количество белка оценивают с помощью денситометрии.

Планируется визуализировать и определить количество белка светособирающего комплекса фотосистемы 2 – Lhcb2 из тилакоидов Arabidopsis thaliana .
Все вопросы и предложения присылать по адресу.

Вестерн - блот (иногда называемый иммуноблот белок ) является широко используемым аналитическим методом используется в молекулярной биологии , иммуногенетики и других молекулярной биологии дисциплин для определения специфических белков в образце гомогената ткани или экстракта.

Вкратце, образец подвергают денатурации белка, а затем гель - электрофореза . Синтетические или животного происхождения антитела (известный в качестве первичного антитела) , который создается распознает и связывается со специфическим белком - мишенью. Электрофорез мембрану промывают в растворе, содержащем первичное антитело, перед тем избыток антитела смывается. Вторичное антитело добавляют, который распознает и связывается с первичным антителом. Вторичное антитело визуализировали с помощью различных методов, таких как окрашивание, иммунофлюоресценции, а также радиоактивности, что позволяет косвенное обнаружение специфического белка - мишени.

Другие родственные методы включают дот - блот анализ, количественную дот - блота , иммуногистохимический и иммуноцитохимию , где антитела используются для обнаружения белков в тканях и клетках иммунной метки и иммуноферментный анализ (ELISA).

Название вестерн - блот это игра на eponymously названием Southern - блот , методика ДНК обнаружения разработан ранее Edwin Southern . Кроме того, обнаружение РНК называют северным кляксу и был разработан Джеймсом Alwine, Дэвид Кемп и Джордж Старк в Стэнфорде . Термин «вестерн - блот» был дан в технике У. Нил Бернетт, хотя сам метод возник в лаборатории Гарри Towbin в .

Приложения

Вестерн - блот широко используется в биохимии для качественного определения одиночных белков и белков-модификаций (например, пост-трансляционной модификации). Он используется в качестве общего метода, чтобы определить наличие определенного одного белка в сложной смеси белков. Полуколичественная оценка белка может быть получена из размера и цвета интенсивности полосы белка на блот - мембране. Кроме того, применение серии разведений очищенного белка известных концентраций может быть использовано, чтобы позволить более точную оценку концентрации белка. Вестерн - блот обычно используется для проверки продукции белка после клонирования . Он также используется в медицинской диагностике, например, в тесте на ВИЧ или BSE -TEST.

Подтверждающий тест на ВИЧ использует вестерн - блот для обнаружения анти-ВИЧ антитела в организме человека в сыворотке образца. Белки из известных ВИЧ -infected клеток разделены и нанесены на мембрану, как описано выше. Затем сыворотка для тестирования применяется в стадии инкубации первичного антитела; свободное антитело вымывает, а вторичное антитело против человеческого связан с сигналом фермента добавляется. Окрашенные полосы затем показывают белки, к которым сыворотка пациента содержит антитело.

Западный блот также используются в качестве окончательного теста для Крейтцфельда-Якоба , типа заболевания приона, связанного с потреблением загрязненной говядины от крупного рогатого скота с бычьей губчатой энцефалопатией (BSE, обычно упоминаются как «коровье бешенство»).

Другое применение в диагностике туляремии. Оценка способности вестерн-блот для выявления антител против F. tularensis показал, что его чувствительность составляет почти 100%, а специфичность 99,6%.

колориметрическое обнаружение

Метод обнаружения колориметрического зависит от инкубации вестерна - блоттинга с субстратом, который взаимодействует с ферментом - репортера (например, пероксидаза) , который связан с вторичным антителом. Это превращает растворимый краситель в нерастворимую форму другого цвета, который выпадает в осадок рядом с ферментом и, таким образом окрашивает мембрану. Развитие блото затем останавливает вымывание растворимой краситель. Уровни белка оценивали с помощью денситометрии (как интенсивное пятно) или спектрофотометрии .

Хемилюминесцентное обнаружение

Хемилюминесцентные методы обнаружения зависит от инкубации вестерн - блоттинга с субстратом, который будет люминесцировать при воздействии репортера на вторичного антитела. Свет затем детектируется ПЗС - камер, которые захвата цифрового изображения на вестерн - блоттинга или фотопленки. Использование пленки для обнаружения Вестерн - блот постепенно исчезает из - за отсутствия линейности изображения (не точной количественной оценки). Изображение анализируется с помощью денситометрии, который оценивает относительное количество белка окрашивания и количественно результаты с точки зрения оптической плотности. Следующее программное обеспечение позволяет дальнейший анализ данных, такие как анализ молекулярного веса, если используются соответствующие стандарты.

После того как ДНК, РНК или белки разделены, они должны быть перенесены на твердую подложку для детекции и других операций, которые в геле идут с трудом. Процесс переноса, приводящий к иммобилизации молекул , т.е. закреплению в неподвижном состоянии, называется блоттингом (по англ. – blotting ). В качестве подложки используются нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны.

Блоттинг (от англ. blotting – промокание) – это метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) одноцепочечные молекулы ДНК.

Саузерн-блоттинг (по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.

Анализ проводят следующим образом:

– Выделенную, очищенную, денатурированную и разбитую на фрагменты ДНК помещают на лист агарозного геля, где происходит электрофоретическое разделение фрагментов по массе и заряду.

– Лист агарозного геля помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором.

– Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, где происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК.

– Поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т.е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой.

– Далее ДНК денатурируют щелочью, а фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 0 С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

– ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК зондом, в котором и происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде светлых полос на рентгеновской пленке, т.е. радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра

Дот-блоттинг . Для приготовления дот-блоттов препарат ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр. Капельки препарата выглядят в виде точек на фильтре, что объясняет название типа блоттинга (англ. dot –точка). 1) Из геномной ДНК, предварительно обработанной ультразвуком, образуются фрагменты длиной 5–10 пар нуклеотидов.

2) Чтобы сделать ДНК- или РНК-пробы доступными зонду, их нужно денатурировать, т.е. перевести в одноцепочечную форму. Это происходит под воздействием температуры 100 °С.

3) Денатурированные нуклеиновые кислоты инкубируют на льду: быстрое понижение температуры предотвращает их ренатурацию, т.е. комплементарное спаривание цепей. Денатурированную ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр, который инкубируют в растворе, содержащем зонд.

4) Чтобы анализируемая нуклеиновая кислота не перешла в раствор, ее необходимо зафиксировать на фильтре (мембране). Для этого используют два типа фильтров: нитроцеллюлозный и нейлоновый.

Для иммобилизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозном фильтре используют прожаривание при 80 °С в вакууме, а на нейлоновом фильтре – УФ-облучение в течение 3–5 минут.

5) После инкубации препарата нуклеиновых кислот с меченым изотопом зондом проводят радиоавтографию в специальной кассете или идентификацию нерадиоактивными методами.

Дот-блоттинг позволяет ответить только на один вопрос: есть ли в данном образце искомая последовательность нуклеотидов.

Нозерн-блотт анализ применяется:

1) для выделения и анализа РНК (например, для выяснения того, присутствует ли в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет;

2) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток;

3) для определения размера транскрипта какого-то гена.

В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда.

Если нуклеотидная последовательность искомого гена (или мРНК) не известна, но известен белок, синтез которого он контролирует, то можно выделить небольшое количество чистого белка, определить аминокислотную последовательность некоторой его части (достаточно знание 5–6 аминокислотных остатков). Пользуясь таблицей генетического кода, можно установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК (или самого гена), который кодирует данную аминокислотную последовательность. В этом случае можно синтезировать зонд для поиска нужных клонов в библиотеке генов.

Вестерн-блоттин г (иммуноэлектроблоттинг, белковый блоттинг) –это метод идентификации уникальных белков. В его основе лежит явление высокоспецифичного взаимодействия антиген–антитело. Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый белок, а зондом – антитело к нему.

Антитела к исследуемому белку получают различными способами. Наиболее простым является введение очищенной пробы белка в кровяное русло лабораторного животного (обычно кролика). В его организме вырабатываются антитела (иммуноглобулины) к данному чужеродному белку. Это первичные антитела, которые и будут взаимодействовать с белком-мишенью.

Однако было бы не рационально вводить метку для идентификации непосредственно в данные антитела. Для определения разных белков потребовалось бы метить разные антитела, что привело бы к их высокой стоимости. Более разумным оказалось использование универсальных антител – конъюгированных антииммуноглобулинов , являющихся, по сути, антителами к антителам, выработанным при использовании идентифицируемого белка как антигена. К примеру, конъюгированные антииммуноглобулины к Ig кролика будут взаимодействовать со всеми иммуноглобулинами, синтезированными у кролика к разным антигенам. Таким образом, именно такие универсальные вторичные антитела несут изотопную или нерадиоактивную метку. Кроме неизотопной метки, которая в ходе ряда реакций приводит к образованию нерастворимого окрашенного соединения (как в случае блоттинга нуклеиновых кислот), очень часто используют хемилюминесцентную метку, обладающую более высокой чувствительностью.

1) Экстракция белков из гомогената

2) Разделение белков по молекулярным массам с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Метод SDS-электрофореза подразумевает денатурацию нативных белков. Таким образом, молекулы белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, пройдут в геле одинаковый путь и выстроятся в виде полосы. Поскольку в смеси присутствуют белковые молекулы разного размера, образуется множество полос. Визуализировать результаты электрофореза можно окрашиванием белка (кумасси бриллиантовый синий, амидо черный, окрашивание серебром). Окрашивание серебром обладает уникальной чувствительностью, что позволяет определить всего 0,1 нг белка в полученной полосе. Это очень важно для контроля количества белка, нанесенного на гель.

3) Перенос белков из геля на мембрану. Это делается потому, что полиакриламид не позволяет диффундировать большим молекулам иммуноглобулинов к белку. А иммобилизованный на мембране белок становится доступным антителам. В отличие от блоттинга нуклеиновых кислот перенос белка на мембрану происходит под воздействием электрических сил, т.е. в электрическом поле.

4) Полученный блот инкубируют с антисывороткой к белку, а затем с антииммуноглобулинами. Результат визуализируют в соответствии с используемым типом метки.

Ограничения:

1) большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу;

2) невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК;

3) необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5-1 мл крови),

4) для геномной гибридизации - наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./мин*мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.

5) большая трудоемкость исследований