Типы ингибирования

Регуляция по типу обратной связи.

Путь нековалентной модификации

В состав ферментов кроме активного центра может входить иной центр - аллостерический, к которому мо­гут присоединяться низкомолекулярные вещества и из­менять активность ферментов. Аллостерический (или регуляторный) центр - участок молекулы фермента, с которым связываются низкомолекулярные вещества-эффек­торы (активаторы или ингибиторы). Их структура отлич­на от структуры субстрата. Присоединяясь к аллостерическому центру, эти вещества (эффекторы) могут изме­нять третичную или четвертичную структуры молекулы фермента и соответственно структуру активного центра, вызывая увеличение или уменьшение его активности. Та­ким образом, связывание фермента с эффектором в одном участке белка вызывает изменение структуры и, следова­тельно, активности - в другом.

Активаторы увеличивают активность ферментов, а ингибиторы уменьшают. Часто биохимический процесс состоит из нескольких стадий, которые катализируются своими ферментами. В таких системах есть хотя бы один фермент - регуляторный, который определяет скорость всей последовательности реакций. Регуляторные фермен­ты под действием эффекторов способны включать и вы­ключать целые цепи реакций метаболизма. Соединения, действующие как ингибиторы этих ферментов, обычно являются конечными продуктами всей цепи реакций. Систему регуляции этого типа, когда избыток продукта одной из последовательных реакций биохимического пути ингибирует активность фермента одной из ранних ста­дий, блокируя эту и все последующие стадии, называют ингибированием по типу обратной связи. Таким образом, накопление избытка продукта ведет к торможению его биосинтеза.

Различают обратимое и необратимое ингибирование ферментов. Ингибирование является необратимым, если ингибитор необратимо связывается с ферментом (образо­ванный комплекс субстрат-ингибитор не распадается). Многие ингибиторы необратимо связываются с фермен­тами, изменяя их структуру. Этим объясняется токсич­ное действие ионов металлов: Hg 2+ , Zn 2+ .

Е - SH + Ag + ® Е - S - Ag + H + ;

в противном случае наблюдается обратимое ингибирование. Обратимое ингибирование, может быть конкурент­ное и неконкурентное.

Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ин­гибитор и субстрат имеют сходные структуры и конкури­руют за связывание с активным центром фермента. Если к ферменту Е добавить конкурентный ингибитор I и субстрат S, то одновременно образуется два комплекса: фер­мент-ингибитор (EI) и фермент-субстратный (ES). Образо­вание комплекса EI не приводит к образованию продук­тов реакции.

Е + S ® ES ® P + Е;

Е + I ® EI ® не образуются продукты реакции

Скорость реакции уменьшается, потому что при присое­динении ингибитора к активному центру субстрата умень­шается число активных центров фермента, способных вза­имодействовать с природным субстратом. Поскольку конкурентный ингибитор связывается обратимо, с фер­ментом, то уменьшить его действие можно, увеличивая концентрацию субстрата, так как при этом увеличивает­ся вероятность связывания фермента с субстратом.

Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.

Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

Аллостерическая регуляция

Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы – клеточные метаболиты часто именно того пути, регуляцию которого они осуществляют.

Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки. Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях:

· при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют осуществлять регуляцию синтеза этих соединений;

· при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ;

· для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ – аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты;

· для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом, конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими эффекторами другого метаболического пути.

Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов:

· обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров или имеющие доменное строение;

· они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от каталитического активного центра;

· эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллостерических (регуляторных) центрах;

· аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть абсолютной и групповой. Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие – к ингибиторам;

· протомер, на котором находится аллостерический центр, - регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего активный центр, в котором проходит химическая реакция;

· аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента;

· регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение эффектора от регуляторной субъединицы восстанавливает исходную каталитическую активность фермента;

· аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного метаболического пути.

Скорость ферментативных реакций может быть частично снижена или полностью заблокирована определенными веществами, так называемыми ингибиторами ферментов. Некоторые ингибиторы ферментов являются для организма животных и человека эффективными лекарственными веществами, другие - смертельными ядами.

Обратимые ингибиторы

Различают три типа обратимого ингибирования ферментов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное.

Конкурентным называют ингибитор, обратимо взаимодействующий с активным центром фермента. Как правило, конкурентные ингибиторы по структуре похожи на субстрат и могут вытесняться из фермент-ингибиторного комплекса избытком субстрата. Взаимодействие с конкурентным ингибитором не приводит к денатурации или инактивации фермента, поэтому при замене ингибитора на субстрат скорость ферментативной реакции не снижается (рис. 6.Ю).

При взаимодействии фермента с конкурентным ингибитором изменяется значение К м соответствующей ферментативной реакции.

Сходство субстрата и конкурентного ингибитора достаточно для взаимодействия и образования фермент-ингибиторного комплекса, но недостаточно для ферментативной реакции. В качестве примера можно привести действие малоновой кислоты на реакцию, которая катализируется сукцинатдегидроге- назой и связана с превращением янтарной кислоты в фумаровую.

Рис. 6.10.

Добавление малоновой кислоты к реакционной смеси снижает или полностью останавливает ферментативную реакцию, так как она является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы.

Сходства малоновой кислоты с янтарной достаточно для образования комплекса с ферментом, однако распад этого комплекса не происходит. При увеличении концентрации янтарной кислоты она вытесняет малоновую кислоту из комплекса, в результате активность сукцинатдегидрогеназы восстанавливается.

Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и животных по конкурентному типу. Примером могут служить сульфамидные препараты, по структуре сходные с л-аминобензойной кислотой (ПАБК). Это соединение в микробных клетках является интермедиантом фолиевой кислоты - важного компонента нуклеинового обмена. При введении сульфамидных препаратов в организм происходит ингибирование ферментов метаболизма ПАБК, что приводит к снижению синтеза нуклеиновых кислот и гибели микроорганизма.

В данном случае сульфаниламид является конкурентным ингибитором фермента синтеза фолиевой кислоты.

В структуру пептогликана клеточной стенки бактерий включен D-аланин, отсутствующий в организме животных и человека. Для синтеза клеточной стенки бактерии при помощи фермента аланин-рацемазы превращают животный L-аланин в D-форму. Аланин-рацемаза характерна для бактерий и не обнаружена у млекопитающих. Следовательно, она представляет хорошую мишень для ингибирования лекарственными препаратами. Замещение одного из протонов метильной группы на фтор дает фтораланин, с которым связывается аланин-рацемаза, что приводит к ее ингибированию.

Таким образом, можно конструировать лекарственные вещества, ингибирующие ферменты по конкурентному типу. Чтобы быть эффективным, ингибитор должен иметь высокое сродство к ферменту. В противном случае необходимо назначать большие дозы лекарственных препаратов, чтобы активно конкурировать с эндогенным субстратом за активный центр фермента.

Неконкурентные ингибиторы взаимодействуют с ферментами не в области активного центра, а на каком-то от него удалении, причем никаким избытком субстрата из комплекса не удаляются. При взаимодействии ингибитора с ферментом происходит изменение его конформации с последующей частичной дезинтеграцией активного центра. При взаимодействии фермента с неконкурентным ингибитором изменяется ферментативной реакции.

Бесконкурентное ингибирование имеет место, когда ингибитор взаимодействует с ферментом только в составе фермент-субстратного комплекса, препятствуя его распаду. Примером необратимого действия ингибиторов на ферменты могут служить фосфорорганические вещества, применяемые в качестве инсектицидов.

Рис. 6.11. График Лайнуивсра-Бэрка для идентификации различных типов ингибирования: а - конкурентное ингибирование; б - неконкурентное ингибирование

Тип ингибирования можно определять графически, используя методы Лайнуивера-Бэрка или Эди-Хофсти (рис. 6.11).

Как видно из рис. 6.11, влияние конкурентного ингибитора на скорость реакции приводит к изменению /Г м, максимальная скорость реакции при этом остается без изменения. Неконкурентное ингибирование связано со снижением V max , без изменения константы Мехаэлиса.

Активность многих ферментов тормозится избытком субстрата, причем имеется несколько механизмов этого процесса.

• Если в образовании фермент-субстратного комплекса участвует несколько функциональных групп фермента, то возможно одновременное присоединение к активному центру двух или более субстратов, что однозначно приведет к образованию неактивного комплекса.
• В случае избытка субстрата возможно его присоединение не только к активному центру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным с активным центром. Такого рода взаимодействие может помешать ферментативной реакции.
• Увеличение конценграции субстрата может повысить ионную силу реакционной среды и, как следствие, затормозить скорость ферментативной реакции.

Торможение продуктами реакции связано с тем, что они могут связываться с ферментом или с каким-либо другим компонентом системы таким образом, что скорость прямой реакции снижается.

Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.

При этом, если константа диссоциации комплекса K s = K m равна:

Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора. Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования , характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина К га не изменяется, а величина V max снижается.

Возможны также промежуточные или альтернативные случаи, например, когда ингибитор связывается не с ферментом, а с фермент-субстратным комплексом, как в случае бесконкурентного ингибирования, при котором изменяются оба кинетических параметра.

Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера-Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.

При конкурентном ингибировании, если определена величина К т в присутствии ингибитора, можно рассчитать константу ингибирования по следующей формуле:

При неконкурентном ингибировании с помощью определения измененной величины V можно рассчитать К. по следующей формуле:

Все биохимические процессы в клетке взаимосвязаны и взаимозависимы, тем не менее часть из них преимущественно выполняет функцию построения клеточного материала, а часть - снабжения источниками энергии этих «строительных работ». Поэтому принято разделять биохимические процессы на два основных типа: ассимиляционные, называемые анаболизмом, включающим синтез низкомолекулярных предшественников и построения из них молекул биополимеров, и диссимиляционные, называемые катаболизмом, состоящим в обеспечение источника энергии, «энергетического привода», приводящего в движение анаболизм.

Рассмотрим основные механизмы процессов трансформации энергии в клетке, т.е. механизмы катаболических процессов.

Ингибирование

– это торможение активности фермента. При этом денатурации ферментов не происходит.

Ингибитор - вещество, вызывающее специфичное снижение активности фермента. Неорганические кислоты и тяжелые металлы ингибиторами не являются, а являются инактиваторами , так как снижают активность любых ферментов, т.е. действуют неспецифично .Так же денатурирующие агенты к ингибитррам не относят.

Ингибиторы: ионы или небольшие молекулы, составляющие часть ферментативной регуляторной системы, а так же фармакологические препараты.

по прочности связывания фермента с ингибитором ингибирование бывает обратимым и необратимым .

по отношению ингибитора к активному центру фермента ингибирование делят на конкурентное и неконкурентное .

Виды ингибирования

1. Обратимое 2. Необратимое

А. КОНКУРЕНТНОЕ А. СПЕЦИФИЧЕСКОЕ

Б. НЕКОНКУРЕНТНОЕ Б. НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ

Обратимое ингибирование . Большинство ингибиторов действуют обратимо, образуя нековалентные связи с ферментом , и при определенных условиях диссоциируют с восстановлением активности фермента.

Конкурентное ингибирование. Ингибитор похож на субстрат фермента по своей структуре и соперничает с субстратом за активный центр (садится на активный центр фермента ), что приводит к уменьшению связывания субстрата с ферментом и нарушению катализа. В этом состоит особенность конкурентного ингибирования – возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата.

Для конкурентного типа ингибирования справедливы следующие уравнения:

Е + S ⇔ ES → E + P,

1. Конкурентное взаимодействие этанола и метанола за активный центр алкогольдегидрогеназы .

2. Ингибирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой , структура которой схожа со структурой субстрата этого фермента – янтарной кислоты (сукцината).

Сукцинат + ФАД ----------- Фумарат + ФАДН 2

3.Также к конкурентным ингибиторам относят антиметаболиты или псевдосубстраты, например, антибактериальные средства сульфаниламиды , схожие по структуре с п -аминобензойной кислотой, компонентом фолиевой кислоты. При лечении сульфаниламидами в бактериальной клетке конкурентно нарушается использование п -аминобензойной кислоты для синтеза фолиевой кислоты , что и вызывает лечебный эффект.

Сходство строения сульфаниламидов и парааминобензойной кислоты, компонента витамина в9

Влияние различных концентраций субстрата на скорость реакции, катализируемой ферментами 1 и 2(в присутствии ингибитора) : а) гиперболическая зависимость V от [ S ], б) прямая зависимость в обратных координатах 1/ V от 1/[ S ] - Лайнуивера-Бэрка.

Конкурентные ингибиторы уменьшают скорость химической реакции. Конкурентный ингибитор повышает К m для данного субстрата (уменьшает сродство субстрата к ферменту). Это означает, что в присутствии конкурентного ингибитора необходима большая концентрация субстрата для достижения 1/2 V max . Увеличение соотношения концентрации субстрата и ингибитора снижает степень ингибирования. При значительно более высоких концентрациях субстрата ингибирование полностью исчезает , потому что активные центры всех молекул фермента будут находиться преимущественно в комплексе с субстратом.

Неконкурентное ингибирование. Ингибитор не имеет структурного сходства с субстратом и присоединеняется не в активном центре , а в другом месте молекулы, одновременно с субстратом. Образуется тройной комплекс: субстрат - фермент - ингибитор. Это ведет к деформации активного центра и каталитической активности. Например, синильная кислота (цианиды) связывается с гемовым железом ферментов дыхательной цепи и блокирует клеточное дыхание.

Кинетическая зависимость неконкурентного ингибирования: характеризуется снижением V max ферментативной реакции и уменьшением сродства субстрата к ферменту, т.е. увеличением К m .

Неконкурентное ингибирование в двойных обратных координатах при различных концентрациях ингибитора (1 - [I]=0; 2 - [I]>0; 3 - [I]>[I]2).

При неконкурентном ингибировании константа Михаэлиса не изменяется, а максимальная скорость реакции уменьшается в (1 + [I ]/K i ) раз. Поэтому в двойных обратных координатах семейство прямых, отвечающих разным концентрациям ингибитора, пересекается в одной точке на оси абсцисс.Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg 2+), серебра (Ag +) и мышьяка (As 3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению (рис. 2-26). При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.