Гистологические срезы затем окрашивают специально подобранными красителями, большинство из которых избирательно окрашивает структурные компоненты клеток и тканей. Все красители можно разделить на три группы:
После окрашивания гистологические срезы быстро обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле или толуоле, переносят на предметное стекло, заливают тонким слоем канадского бальзами или полистирола и накрывают покровным стеклом. Бальзам, полистирол и стекло имеют одинаковый показатель преломления света, и лучи света минимально рассеиваются, проходя через препарат.
При подозрении на злокачественное заболевания точно выставить диагноз можно только после ряда обследований, самым главным из которых считается гистологическое исследование.
Под этим методом понимают микроскопическое изучение образца тканей из тела человека, полученных при биопсии или во время операционного вмешательства. Гистологию обязаны назначать практически всем пациентам, имеющим данные за развитие не только злокачественных, но и доброкачественных опухолей.
Цели гистологического метода исследования биопсийного материала
Гистологическое исследование назначается для решения сразу нескольких задач. Этот анализ необходим для:
- Подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза.
- Определения ранней стадии тяжелых, в том числе и .
- Изучения протекания патологического процесса в динамике.
- Правильного выбора техники операции при необходимости удаления новообразований.
- Дифдиагностики, позволяющей точно разделить две сходные по признакам патологии.
- Определения структурных нарушений, образующихся в тканях в период лечения.
На сегодня хирургическое вмешательство, сеансы облучения и химиотерапия больным даже с уже явным протеканием злокачественного процесса без предварительно проведенной гистологии не назначаются.
Морфологическое изучение биоматериала позволяет подобрать адекватную схему терапии и при неопухолевых процессах.
Исследование востребовано в торакальной и абдоминальной хирургии, оториноларингологии, пульмонологии, гинекологии, гастроэнтерологии. При необходимости гистологическое лечение назначается пациентам с заболеваниями крови, мочеполовой системы.
Техника выполнения процедуры
Для пациентов с подозрением на злокачественную опухоль назначается прижизненное гистологическое исследование.
Биоматериал при необходимости можно получить практически из любого места человеческого тела, для этого используют:
- Эксцизионную биопсию – получение тканей путем иссечения при проведении операции.
- Пункционную биопсию. Проводится пункция патологического очага и при помощи иглы извлекается кусочек тканей.
- Вырезание биоматериала из удаленных органов.
- Щипцовую биопсию, то есть скусывание специальными щипцами необходимой части патологического образования. Этот вид биопсии возможен при проведении эндоскопического обследования – колоноскопии, эзофагогастродуоденоскопии, бронхоскопии.
- Кюретаж – выскабливание патологического очага с органов с полостями или с тех полостей, которые образовались в результате злокачественного процесса.
- Аспирационную биопсию – отсасывание при помощи шприца секрета из полого органа.
Метод получения биоптата в основном определяется заранее. Во время любой процедуры необходимо придерживаться правил взятия материала. Если их не полностью соблюдать, то возможны серьезные ошибки при проведении анализа.
Нередко лечащий или оперирующий врач планирует забор совместно с патологоанатомом, именно этот доктор имеет специализацию по гистологии. Не возбраняется и присутствие патологоанатома на операции, он укажет точное место забора образца тканей, определит его объем и метод фиксации.
Небольшой патологический очаг иссекают всегда полностью, захватывая кусочек здоровой окружающей ткани в 1-2 см шириной. Если операция назначена по поводу доброкачественной опухоли, то хирургическое вмешательство является радикальным. Хирургам необходимо при выборе техники манипуляции учитывать и косметический результат лечения.
Если технически невозможно убрать новообразование полностью, то объем иссеченного образца тканей должен быть максимально большим. Необходимо кусочек тканей брать там, где определяется зона отчетливой патологии.
В процессе иссечения нельзя забывать о том, что травматизация органов должна быть минимальной. Правильно требуется и иссекать ткани, если подобные воздействия слишком изменят структуру образца, то верно провести гистологию будет невозможно.
При использовании электроножа необходимо чтобы линия отсечения находилась на расстоянии не менее 2 мм от основного очага. К биоматериалу необходимо относиться с максимальной осторожностью – не допускается его сминать пальцами либо инструментами. Образец тканей удерживают только за здоровую полоску биоматериала.
Гистологическому исследованию по стандартам подвергается не только специально забранный биоматериал, но органы и ткани, удаленные при проведении операций.
Высокие требования предъявляются к оформлению документации. Врач-клиницист должен промаркировать биоптат, внести в протокол данные о характере операции, кратко описать удаленную часть органа или новообразование. В документах указывается, какие образцы тканей и сколько направляются в патологоанатомическое отделение.
Оперирующий хирург заполняет направление на гистологию, проверяет точность данных пациента на наклейке на лабораторной емкости с биоптатом. Наклейка должна находиться на боку самой емкости, так как не исключается ошибочная замена крышек у одинаковых банок. Обязательно следует следить за четкостью заполнения всех граф направления.
Разборчиво пишут инициалы пациента, его возраст, домашний адрес, обязательно помечают локализацию патологии, связь биоматериала с окружающими его связками, мышцами, органами.
Если есть возможность немедленной отправки забранного материала на исследование, то его не помещают в фиксирующий раствор. Но нужно учитывать, что длительно находиться в первоначальном виде биоптат не может, так как он подсыхает, и достоверный анализ не получается. Чем меньше по размерам образцы тканей, тем быстрее они теряют влагу.
В случае отсутствия возможности проведения гистологи немедленно биоптат прямо на месте его забора следует зафиксировать. Для фиксации используется 10% формалина, этого раствора должно быть в 15 раз больше по сравнению с отправляемым на анализ кусочком тканей.
Если биоптат отличается большими размерами, то рекомендуется для лучшего проникновения в него формалина сделать небольшие размеры, но так чтобы не изменить качество правильно забранного материала. Не допускается сквозное проведение надрезов и их количество должно быть самым минимальным.
Уносить или увозить материал в патологическое отделение должен только медработник с соответствующим допуском к этому виду работ. Отправка и получение материала фиксируются документально.
Запрещено делить биоматериал и отправлять его в разные лаборатории, так как многие опухоли отличаются неоднородностью строения. Поэтому гистология с разных мест будет по результатам неодинакова и это не позволит правильно выбрать верную тактику лечения.
Несколько образцов биоматериала из одного очага берется в том случае, если новообразование неоднородно или четкой границы опухоли нет.
Если материал для гистологии взять согласно всем правилам, то в зависимости от вида исследуемой ткани результат может быть готовы через 5-15 дней. Дольше всего проводится анализ костной ткани.
Результаты
Высокая точность гистологического анализа объясняется тем, что морфологическое исследование выполняется под микроскопом.
То есть у диагноста есть возможность вживую рассмотреть биоматериал и определить в нем патологические изменения без использования или УЗИ.
Перед непосредственном осмотре тканей под микроскопом она окрашивается специальным реактивом, что позволяет четко увидеть все отклонения от нормы. При исследовании гистологических биопрепаратов врач указывает микроскопические изменения, проводит анатомический анализ выявленных изменений.
В заключении врач может дать несколько вариантов результатов:
- Ориентировочный ответ выставляется, когда полученные данные трактуются в пользу нескольких диагнозов. То есть необходима дополнительная дифдиагностика.
- Заключительный ответ позволят на основании гистологии выставить точный диагноз.
- Описательный ответ лаборант оставляет, если биоматериала недостаточно или нет достаточных сведений о характере заболевания.
В тех случаях, когда биопрепарата для изучения мало или материал забран так, что в нем больше здоровых тканей, выставляется «ложноотрицательный» результат. «Ложноположительный» ответ указывается, если в направлении отсутствуют клинико-лабораторные данные о пациенте.
Для того чтобы избежать ложных анализов требуется совместная работа патологоанатома и врача-клинициста. Врачи должны совместно тщательно обсудить все выявленные изменения при анализе, изучить историю болезни пациента.
В тех случаях, когда гистология назначается с диагностической целью, в заключении дают микроскопическое описание и пишут нозологическое заключение. При написании заключения в России руководствуются специальной медицинской номенклатурой.
На искажение результатов гистологии влияет неправильное фиксирование и хранение биоматериала, грубые ошибки при заборе биоптата. На точность анализа влияет и классификация диагноста. В норме в исследуемом образце клеточные изменения должны отсутствовать.
Исследование шейки матки и эндометрия
В гинекологии часто используется гистологическое исследование эндометриальных тканей. Оно позволяет установить нарушения в функционировании яичников и выявить ряд заболеваний, к ним относят и онкологию.
Тем пациенткам, у которых менструальный цикл не изменен, диагностическое выскабливание назначается за три дня до предполагаемой даты критических дней. При дисфункциональных кровотечениях чистку с забором материала для гистологии проводят, не дожидаясь остановки кровотечения.
Полученный биоматериал окрашивают, применяя гематоксилин или эозин. Проведение анализа позволяет выявить все особенности и изменения в эндометрии, определяется строение стромы и железистых клеток.
В норме железы в лютеиновую фазу менструального цикла приобретают пиловидную форму и немного расширяются.
Клетки желез должны иметь светлую цитоплазму и бледные ядра, в железах в обязательном порядке должен быть в норме обнаружен секрет.
Если при гистологическом исследовании соскоба с шейки матки определяется незначительное изменение, то это свидетельствует о развитии доброкачественной опухоли либо о воспалении. При обнаружении огромного числа измененных клеток не исключается предраковое состояние или злокачественный процесс.
Гистология родинки
Гистология родинки () назначается, в том случае, если имеются признаки, указывающие на возможное родимого пятна.
Это могут быть боли в месте родинки, быстрое увеличение ее в размерах, появление выделяющегося секрета или сукровицы, потемнение бледных невусов.
Для получения биоматериала необходимо беспокоящую родинку удалить полностью.
После чего ее помещают в фиксирующий раствор и направляют на исследование. Определение атипичных клеток с определенной структурой свидетельствует о злокачественном перерождении. При гистологическом исследовании родинки можно определить вид образования, характер и стадию воспалительного процесса.
Гистология родинки в специальных лабораторных отделениях проводится по направлению от врача или по желанию обратившегося к ним пациента. Раннее выявление злокачественных клеток позволит вовремя провести комплексное лечение, обеспечивающее полное выздоровление онкобольного.
Гистология прямой кишки
Материал для гистологического исследования тканей прямой кишки в основном берется при проведении колоноскопии. Используется два вида гистологического анализа:
- Срочное исследование выполняется в течение 30-40 минут. Проводят его прямо во время операции на прямой кишке, и от полученных результатов зависит объем удаляемой опухоли вместе с окружающими тканями.
- Плановое исследование занимает не менее 5 дней. Его данные по сравнению со срочным более достоверные.
Гистология биоптата из прямой кишки позволяет выяснить, имеется ли злокачественное перерождение клеток, как в нижних, так и в верхних отделах органа.
Цена
Стоимость гистологического исследования биопсийного материала зависит от категории сложности анализа:
- Гистология биоматериала первой категории (сюда относят биоптат полученный при оперировании пациентов с неспецифически протекающим острым и хроническим воспалением) – стоит в пределах 2500-3000 тысяч рублей.
- Гистология третьей категории (при отсутствии данных за онкологию) стоит около 3500 рублей.
- Гистология четвертой категории стоит от 4-х тысяч рублей.
Нужно сказать, что в государственных учреждениях по направлению от врача гистологическое исследование делают бесплатно.
Тема 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.
Выделяются следующие виды микроскопии:
1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);
2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);
3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);
4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);
5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);
6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;
7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);
8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.
Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.
Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.
Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.
Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.
Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.
Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.
Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.
Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.
Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.
Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.
1. Взятие материала – кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:
1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;
2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;
3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;
4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.
2. Фиксация материала . Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.
3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.
4. Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей . После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.
5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.
6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле . Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.
После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.
Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.
Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.
Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.
Методы гистологического исследования. Современная гистология имеет широкий арсенал разнообразных методов исследования. Все эти методы объединяет требование применения специального прибора - микроскопа, и поэтому все они микроскопическими методами.
Зависимости от состояния исследуемого объекта эти методы разделяют на гостиной (или Суправитальное), когда изучаются живые клетки, ткани, органы и даже целые организмы, и поствитальни, когда исследуют мертвые фиксированные объекты.
Становление поствитального метода, или метода изготовления постоянного гистологического препарата, происходило параллельно со становлением самой науки гистологии во второй половине XIX в. Его называют еще методом классической гистологии. Этот метод, называется гистологической или микроскопической техники, требует достаточно сложной подготовки объекта исследования. Последняя является предметом для написания специальных, достаточно больших по объему пособий. Студенту, который начинает изучать гистологию, необходимо ознакомиться с основами техники изготовления гистологических препаратов, для того чтобы лучше понять эти препараты и научиться анализировать, "читать", ибо именно постоянные гистологические препараты широко используются как в учебном процессе, так и в научных исследованиях.
Первый этап при изготовлении препарата - получение материала. Уже на этом этапе, как и на всех последующих, следует избегать излишнего травмирования объекта. Поэтому, вырезая кусочек органа или ткани, надо брать острые ножницы или лезвие, не сжимать ткань пинцетом. Кусочки берутся небольших размеров - около 1 см3 (лучше 7x7x3 мм). Материал должен быть свежим, принимать его нужно как можно скорее после забивки экспериментального животного или смерти человека.
Следующий этап - фиксация материала, осуществляется путем погружения взятого кусочка в фиксирующие жидкости. Целью этого этапа является закрепление гистологических структур и макромолекул в том месте и состоянии, в котором они были в живом объекте. Конечно фиксаторы обусловливают определенные изменения прижизненного состояния структур, но можно подбором специальных фиксировали-ных агентов свести эти изменения к минимуму. Фиксаторами служат спирты (этиловый, метиловый), растворы формалина, соли тяжелых металлов, кислоты (уксусная, пикриновая, осмиевая). Чаще применяются различные сложные фиксирующие смеси, включающие названные компоненты в различных соотношениях.
Третий этап - обезвоживание фиксированного материала. Для этого используют спирты различных концентраций, постепенно возрастают от 50-70 до 100 градусов. Обезвоживание необходимо для следующего этапа - уплотнение объекта, осуществляется в парафине, целоидини, синтетических смолах. Подавляющее большинство этих веществ с водой не смешивается, и поэтому для пропитки ими материала необходимо тщательно удалить воду из ткани, а затем пропитать ее ксилолом (толуолом, бензолом), то есть веществом, хорошо растворяет парафин, а также смешивается со 100-градусным этиловым спиртом. После пропитки объекта жидким парафином при температуре 55-5б ° С ему дают затверднуты при комнатной температуре вместе с парафином в специальных формочках. Так получают парафиновый блок. Эта процедура называется заливкой. Ускоренное уплотнение достигается путем замораживания кусочков ткани сухим льдом (двуокисью углерода) или жидким азотом, однако структура исследуемых гистологических объектов сохраняется в таком случае хуже.
Уплотнение материала позволяет изготовить из него тонкие (толщиной 5-7 мкм), пивтонки (0,5-1 мкм) срезы, используемые для световой микроскопии, для электронной микроскопии используют ультратонкие срезы (0,05-0,2 мкм). Изготовление срезов проводят на специальных приборах-микротомы (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии). Тонкий, пивтонкий или ультратонкий срезы являются прозрачными для световых лучей или пучка электронов объектами и дают возможность изучения их под соответствующими микроскопами. Для того, чтобы различать структурные детали объекта, большинство которых не имеют естественного контраста, полученный срез надо красить (для изучения под световым микроскопом) или контрастировать (для электронной микроскопии).
В гистологии существует много методов окраски препаратов и применяется много различных красителей зависимости от цели исследования. Гистологические красители по происхождению делятся на растительные, животные и синтетические (анилиновые). Примером растительных красителей является гематоксилин, получаемый из коры кампешевого дерева, растущего в Центральной Америке, а животных кармин, который получают из насекомых - кошенили. Абсолютное большинство красителей являются синтетическими - эозин, фуксин, азур т.д..
Важнейшей является классификация гистологических красителей по химическим свойствам, поскольку на ней основывается ряд понятий и терминов, которые будут встречаться на протяжении всего курса. Итак, по химическим свойствам гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. Свойства кислых красителей оговариваются группами-СООН,-HS03,-Н2Р03, это так называемые анионные красители. Кислые красители окрашивают цитоплазму клетки, их называют цитоплазматическими. Примером таких красителей могут быть эозин (дает ярко-розовый цвет), светлый зеленый (дает зеленый цвет). Гистологические структуры, способные закрашиваться кислыми красителями, называют оксифильных (ацидофильными, эозинофильными). Это, например, цитоплазматические гранулы эозинофильных лейкоцитов, коллагеновые волокна и т.п..
Основные красители являются катионными, подавляющее большинство их в составе молекулы должно положительно заряженные атомы азота. Названы красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. Примером могут служить гематоксилин (красит в сине-фиолетовый цвет), кармин (в светло-красный), сафранин (темно-красный), азур II (в синий). Гистологические структуры, способные закрашиваться основными красителями, называют базофильными. Это гранулы в цитоплазме базофильных лейкоцитов, ядра клеток и т.п..
Нейтральные красители образуются в случае сообщения водных растворов кислого и основного красителей, например, еозиново-кислый метиленовый синий. Кроме того, следует различать нейтральные красящие смеси, когда в растворе одновременно имеются основной и кислый красители. Структуры, которые одновременно воспринимают и основные и кислые красители, называют нейтро профильной-ми, или полихроматофильнимы. Примером могут служить гранулы нейтро профильных лейкоцитов, цитоплазма полихроматофильних эритро-бластов т.д.. Способность гистологических структур менять цвет основного красителя обозначается термином метахромазии. Метахроматические окрашивается зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани и т.д.. Препараты обычно красят, сочетая один кислый и один основной краситель, что позволяет выявить ядро, цитоплазму и все базофильные и оксифильные структуры. Одними из наиболее часто объединяемых красителей является гематоксилин и эозин.
Кроме кислых, основных и нейтральных красителей существуют специальные, используемые для выявления определенных веществ или структур. Например, судан III окрашивает жировые вещества в оранжевый цвет, а орсеином - эластичные волокна в бурый.
Крашеные препараты обычно обезвоживает в спиртах, просвещают в ксилоле и заливая тонким слоем канадского бальзама, накрывают покровным стеклом. После высыхания бальзама получают постоянный препарат, которым можно пользоваться в течение длительного времени. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротомах, размещают на специальных сеточках, контрастируют солями урана или свинца, просматривают через микроскоп и фотографируют. Полученные микрофотографии являются объектом изучения одновременно с гистологическими препаратами.
Кроме описанных тонких срезов есть еще другие виды гистологических препаратов, которые используют значительно реже, лишь в отдельных случаях. К ним относятся мазки (крови, костного мозга, слюны и т.д.), отпечатки (печени, тимуса, слизистой оболочки мочевого пузыря), пленки (соединительной ткани, плевры, брюшины, мягкой мозговой оболочки), тотальные препараты (зародыши ранних стадий развития, половые клетки).
Гостиные (прижизненные) методы исследования клеток или тканей дают возможность получить информацию о том, как в них происходят процессы жизнедеятельности, проследить движение, разделение, рост, взаимодействие клеток, их реакцию на действие различных факторов. Прижизненные методы исследования - необходимое дополнение к тем данным, которые получены методом классической гистологии о строении клеток, тканей. Прижизненные исследования проводят в живом организме, то есть in vivo. Для исследования живых клеток используют методы поздравительное и Суправитальное окраску. Для этого применяют специальные, не токсичны для живых тканей, красители. При поздравительное окраски краситель вводят в организм живого животного и он избирательно окрашивает определенные клетки. Так исследуют клетки макрофагичнои системы при условии введения трипанового синего или литиевого кармина. Суправиталь-не окраска - это окраска живых клеток, изолированные из организма. Так обнаруживают лизосомы (краситель нейтральный красный), митохондрии (Янус зеленый), ретикулоциты крови (бриллиант-крезиловий синий).
Для поздравительного или Суправитальное, а также поствитального исследований неокрашенные гистологических объектов используют ряд специальных методов световой микроскопии - фазоконтрастну, темнопольову, флуоресцентную.
Метод фазового контраста обеспечивает необходимую контрастность исследуемых неокрашенные структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещается в конденсор, и так называемой фазовой пластинки, содержащейся в объективе. Такая конструкция оптики светового микроскопа позволяет преобразовывать фазовые изменения света, проходящего через объект, в амплитудные, которые замечает глаз как изменения яркости.
Предмет гистология. Методы гистологических исследований. Клеточная теория.
ВВЕДЕНИЕ В ГИСТОЛОГИЮ. СТРОЕНИЕ КЛЕТКИ.
Лекция 1
Гистология – это наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей материи. Ткани изучают в живом и неживом состоянии. Изучение гистологических объектов, их тончайшей структуры проводят при помощи микроскопов, которые увеличивают невидимые простым глазом детали строения в несколько сотен тысяч раз.
Курс гистологии условно разделен на следующие разделы:
1. Цитология - наука о клетке.
2. Эмбриология - наука о развитии, от зарождения до полного формирования организма.
3. Общая гистология - наука об общих закономерностях, присущих тканям.
4. Частная гистология – наука о строении, развитии органов и систем.
Главной задачей гистологии как предмета является получение знаний о микроскопическом и ультрамикроскопическом строении клеток, тканей органов и систем здорового организма, в неразрывной связи с их развитием и выполняемыми функциями.
Основными методами гистологических исследований являются микроскопирование и специальные (немикроскопические) методы (гистохимия, цитофотометрия, авторадиография и др.).
Объектами исследования могут быть живые или мертвые (фиксированные) клетки и ткани.
Для изучения клеток и тканей под микроскопом изготавливают гистологические препараты.
Основными методами исследования гистологических объектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в клинической и экспериментальной практике.
Светооптические микроскопы. Основная оптическая часть микроскопа состоит из объектива и окуляра. Объектив является наиболее ответственной оптической системой, дающей увеличенное изображение предмета. Окуляр - оптическая система, которая служит в качестве лупы при визуальном наблюдении увеличенного изображения предмета, даваемого объективом. Окуляр обычно увеличивает изображение в 5-25 раз.
Так же важнейшими характеристиками микроскопа являются разрешающая способность и увеличение. Разрешающая способность - минимальное расстояние между двумя точками объекта, которые видны раздельно. Увеличение микроскопа- величина, показывающая, во сколько раз линейные размеры изображения, формируемого оптической системой микроскопа, больше линейных размеров объекта. Увеличение микроскопа зависит от увеличений объектива и окуляра и численно равно произведению этих увеличений. Современные оптические микроскопы имеют предел полезного увеличения до 1500 раз.
Электронная микроскопия. Электронные микроскопы обладают высокой разрешающей способностью. Другими словами, в электронном микроскопе теоретически возможно повышение разрешающей способности и соответственно увеличение изображения в 150000 раз больше по сравнению со световым микроскопом. Наиболее часто в морфологических исследованиях используются просвечивающие электронные микроскопы, позволяющие получить плоскостное изображение изучаемого объекта. В последние годы активно применяются растровые (сканирующие) электронные микроскопы, способные создавать трехмерные изображение, т. е. получать пространственное изображение структур.
Методы количественного исследования микроструктур в гистологических и цитологических препаратах. Количественная оценка микроструктур является необходимым условием получения объективных данных об их состоянии в норме, при экспериментальных воздействиях и в патологии. Основными количественными показателями микроструктур являются морфометрические (число структур и их геометрические параметры) и денситометрические, отражающие концентрацию (оптическую плотность) химических веществ в микроструктурах. Для выявления этих параметров применяют морфометрические и спектрофотометрические методы, а также автоматизированные системы обработки изображений.
Изучение организма на тканевом и клеточном уровнях требует приготовления гистологических препаратов и их рассмотрения под микроскопом. Цель приготовления гистологического препарата заключается в том, чтобы путем обработки привести исследуемый материал в удобное для изучения под микроскопом состояние, сделать его прозрачным и контрастным.
Часто изучение материала в свежем виде является наиболее целесообразным (например, наблюдение за работой ресничек мерцательного эпителия). Для приготовления препарата берется чистое предметное стекло. На его середину помещается капля воды или физиологического раствора, в которую погружают кусочки ткани, подлежащей рассмотрению, и под контролем микроскопа расправляют их препаровальными иглами.
Чтобы сделать препарат контрастнее и получить возможность хорошо различать отдельные его детали, объект подвергают окрашиванию. При этом пользуются тем, что разные структуры тканей и клеток по-разному реагируют на тот или иной краситель.
Изготовление постоянных препаратов требует довольно большой затраты труден времени, такие препараты можно использовать в течение многих лет. Препараты готовят из небольших целых объектов (тотальные препараты) или срезов; При всех условиях объект или срез должен быть тонким и прозрачным, иначе невозможно его изучение под микроскопом.
Изготовление препарата состоит из нескольких этапов.
