В данной обзорной статье рассматриваются основные понятия о мембраносвязанных рецепторах врожденного иммунитета – Толл-подобных рецепторах, основные методы определения их экспрессии, применяемые в клинических исследованиях, а также полученные с их помощью результаты. Перспективы будущих исследований основаны на получении полной информации о функционировании систе­мы TLR , также необходима комплексная оценка всех ее звеньев. Это позволит уточнить и ло­кализовать молекулярные дефекты нарушений в системе врожденного иммунитета, а также оценить их роль в патогенезе широкого круга заболеваний.

И ндивидуальная восприимчивость организма к инфекциям определяется патогенностью микроорганизмов, факторами окружающей среды и состоянием иммунной системы . Защита на местном уровне после инфицирования осуществляется прежде всего типичной воспалительной реакцией, которая направлена на распознавание и уничтожение патогена и его компонентов. В- и Т-лимфоциты, осуществляющие адаптивный иммунный ответ, распознают патогены, используя высокоаффинные рецепторы. Однако развитие адаптивного иммунитета обычно происходит достаточно медленно, так как предполагает активацию, пролиферацию лимфоцитов и синтез ими белков: цитокинов и иммуноглобулинов. Более быстрое развитие иммунных реакций обеспечивается врожденным иммунным ответом, который распознает патогены при помощи специальных рецепторов более широкой специфичности, чем рецепторы лимфоцитов. Эти рецепторы распознают молекулярные структуры, общие для целых групп инфекционных возбудителей, в первую очередь к ним относятся Толл-подобные рецепторы (TLR). TLR взаимодействуют с молекулярными структурами, которые не существуют у человека, но присутствуют на патогенах . TLR широко распространены в клетках макроорганизма. Они индуцируют активацию и экспрессию специфических генов, экспрессия которых контролирует механизмы, обеспечивающие деструкцию внедряющихся патогенов. В результате активации через TLR возникает широкий спектр биологических реакций – от индукции синтеза провоспалительных цитокинов и интерферонов (обеспечивающих реализацию реакций врожденного иммунитета) до экспрессии костимулирующих молекул, которые способствуют активации Т-лимфоцитов и стимулируют развитие адаптивного иммунного ответа .

Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на многих клетках способствуют вовлечению TLR в патогенез многих забо­леваний. Дефекты в системе TLR, такие как нару­шения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных мо­лекул, а также полиморфизм генов TLR могут при­водить к развитию тяжелых инфекционных заболе­ваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболе­ваний, атеросклероза, аллергопатологии . Дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной чув­ствительности к инфекциям. Так, дети с мутацией в гене, кодирующем IRAK-4-киназу, с раннего воз­раста страдают тяжелыми пиогенными инфекция­ми, вызванными грамположительными микроорга­низмами . В то же время чрезмерная активация сигнального каскада от TLR ассоциирована с раз­витием сепсиса, воспалительных заболеваний ки­шечника, может вызывать деструкцию тканей. Количество выявленных связей различных патологий с нару­шениями в системе TLR растет. В свя­зи с этим необходимы адекватные и надежные методы оценки компонен­тов системы TLR для выявления иммунодефицитных состояний, связанных с нарушениями функциональной актив­ности TLR, которые могут быть вос­произведены в условиях стандартной клинической лаборатории .

Определение экспрессии TLR . Экспрессию TLR на поверхности клеток чаще всего определяют с помощью метода иммунофлуоресценции. Принцип этого метода заключается в том, что в нем используются меченные флуоресцентными красителями моноклональные антитела (МКАТ) против CD — маркеров данного типа клеток одновременно с меченными другим флуорохромом МКАТ к изучаемому TLR (метод «двойной метки»). В качестве примера приведем краткое описание метода определения TLR2 и TLR4 на моноцитах при изучении взвеси мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови, приведенных в работе .

Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови выделенные на градиенте фиколл-урографина мононуклеарные клетки ин­кубировали с FITC-меченными антителами к СD14 + , РЕ-меченными антителами к TLR2 и TLR4 с соответствующими изотипическими контролями в течение 30 мин при 4 0 С. Анализ экспрессии CD 14 + , TLR2 и TLR4 проводили на проточ­ном цитофлуориметре. Оценивали процент моноцитов (CD 14 + -клеток), несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4, и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флуоресценции.

Проточная лазерная цитометрия. Подготовку проб для проточной цитометрии обычно проводят следующим образом: ядросодержащие клетки периферической крови выделяют путем осаждения эритроцитов 3% раствором желатина. Перед внесением антител клеточную сус­пензию для исследования экспрессии внутриклеточных TLR предварительно обрабатывают фиксирующим пермеабилизирующим раствором. Изучение экспрессии поверхностных TLR не требует обработки этим раствором, поскольку TLR1, 2, 4, 6 и 10 являются преимущественно мембраноассоциированными. Обработка вторичными анти-мышиными антителами, меченны­ми FITS или РЕ, также должна соответствовать общепринятым стан­дартам. В качестве изотипического контроля цитометрических замеров используют IgG-фракцию от неимунизированных мышей. Конечная концентрация для анализа составляет 2х10 6 клеток/мл. Проточную лазерную цитометрию проводят на приборе с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Цитограммы исследуемой кле­точной взвеси выводят на основе регистрируемых параметров малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме dot-plot. Анализ интенсивности флуоресцен­ции и процента флуоресцирующих клеток проводят в зеленой области (FITS) FL1 (530 нм) и оранжевой области (РЕ) FL2 (585 нм). Клетки анализируют в лучах аргонового лазера при скорости потока 5000 клеток/с. Среднюю интенсивность флуо­ресценции клеток выражают в условных единицах флуоресцен­ции (УЕФ) .

Уровень экспрессии мРНК генов TLR обычно определяют методом ПЦР в режиме «реального времени» (РВ), совмещенной с обратной транскрипцией с ис­пользованием специфических праймеров. Например, экспрессия генов TLR2 и TLR4 может быть осуществлена с помощью следующих праймеров: к TLR-2 – TLR2-F1-CCTТCACTCАGGAGСAGCААGC, TLR2-R1 – TGGAAACG-GTGGCACAGGAC; к TLR-4 – TLR4TF6 – GAAGGGGT-GCCТCCATTTCAGC, TLR4-R6 – GCCTGAGCAGGGTCT-ТСТССА. Уровни экспрессии мРНК TLR контролируют (стандартизируют) по гену GАPTAH (GAPDH-F1 - TGC-MTCCTGCACCACCAACT; GAPDH-F2 – YGCCTGCTTCAC- САССТТС) за счет сходной экспрессии этого гена в тканях человеческого репродуктивного тракта .

В настоящее время с помощью данных методов были проведены десятки исследований в области изучения Толл-подобных рецепторов при различных заболеваниях человека. Примером может служить работа «Экспрессия Толл-подобных рецепторов в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом», в которой проведён сравнительный анализ экспрессии рецепторов TLR и NОD-2 в ткани но­совых полипов и на клетках периферической крови и оценена роль этих показателей в патогенезе полипозного риносинусита .

Исследователями показано, что в результате исследования из всех изученных TLR и NОD-рецепторов наибольшее патогенетическое значение имеет достоверное усиление экспрессии рецепторов TLR4 и TLR5 на гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах периферической крови и на клетках вос­палительного инфильтрата в носовых полипах, а также достоверное угнетение экспрессии TLR7 на этих же клетках. Известно, что активация врожденного иммунитета, усиление экспрессии TLR влечет за собой множество патофизиологических послед­ствий . В отношении иммунопатогенеза полипозного риносинусита, где бактериальная и грибковая инфекция играет роль триггера иммунного воспаления in situ, наиболее значимые по­следствия заключаются в гиперпродукции провоспалительных цитокинов и хемокинов, что является главным фактором формирования клеточного воспалительного инфильт­рата. Характерна также интенсификация фагоцитарной и антигенпрезентирующей функции клеток макрофагально-моноцитарного ряда, сопровождающаяся гиперпродукцией медиаторов воспаления. Как следствие, развивается и активация системы адаптивного им­мунитета, обеспечивающей развертывание антигенспецифического лимфоцитарного иммунного ответа in situ .

В работе авторами разработан подход к оценке компонентов системы TLR у здоровых людей, у пациентов с иммунопатологией (общей вариабельной иммунологической недостаточностью – ОВИН) и при острых патологических процессах неинфекционного генеза на примере острого инфаркта миокарда – ОИМ .

Функцио­нальную активность TLR оценивали по выработке ФНО-α моноцитами периферической крови человека в от­вет на лиганды TLR. ФНО-α – один из основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих разви­тие воспалительной реакции. В предложенном методе авторы использовали мононуклеарные клетки, а не цельную кровь, так как растворимые ингибиторы TLR, цитокины, предсуществующие в плазме, могут негативно вли­ять на оценку функций TLR.

В результате исследований было показано, что мононуклерные клетки больных ОВИН характеризуются низким приростом уровня ФНО-α в ответ на лиганды TLR2, 6, 4 и 5 in vitro. Это может приводить к ослаблению защитных функций организма у этих больных при повторном инфицировании in vivo. При развитии острых патологических состоя­ний, таких как ОИМ, важную роль играют клетки врожденного иммунитета – нейтрофилы, макро­фаги, а также провоспалительные цитокины. Их экспрессия может быть индуцирована при актива­ции клеток через рецепторы врожденного иммунитета. При изу­чении спонтанной и индуцированной лигандами TLR выработки ФНО-α мононуклеарными клетками больных ОИМ, авторами было показано, что прогностическим признаком неблагоприят­ного исхода заболевания может слу­жить дополнительное увеличение выработки ФНО-α мононуклеарными клетками больных в ответ на лиган­ды TLR ЛПС и зимозан к 14-м суткам после раз­вития ОИМ в сравнении с индуцированной выра­боткой ФНО-α в 1-е сутки заболевания .

В работе изучалась взаимосвязь уровней мРНК TLR2 и TLR4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин.

Авторами была установлена взаимосвязь иммуноглобулинового профиля и экспрессии мРНК рецепторов врожденного иммунитета клеток цервикального канала (ЦК) в патогенезе урогенитального хламидиоза (УГХ). Показано, что уровень IgG, IgM, IgA, slgA, а также экспрессия рецепторов TLR2 и TLR4 опреде­ляют и характеризуют течение инфекционного процесса, выраженность клинических проявлений и исход заболевания.

Повы­шение уровня экспрессии TLR2 и TLR4 в сочетании с повышением локального синтеза slgA мо­жет способствовать развитию преимущественно локального воспаления и благоприятному исходу заболевания. Как считают исследователи, данные показатели могут использоваться в ка­честве дополнительных критериев в оценке формы хламидийного процесса и остроты его протекания.

В работе изучалась роль Толл-подобных рецепторов в разви­тии иммунного воспаления в коже у больных псориасом. Изучение количе­ства и распределения толл-подобных рецепторов TLR2, TLR4 и TLR9 в структурах кожи про­водилось иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител. Авторами установлена по­вышенная экспрессия TLR2 и TLR4 на клетках эпидермиса и на эндотелиальных клетках сосудов больных псориасом, при отсутствии экспрессии TLR9. По мнению авторов, это способствует развитию хронических воспалительных реакций.

В работе изучалась ассоциация полиморфизма в генах TLR2 и TLR9 с преждевременными родами инфекционного генеза и внутриутробным инфицированием. Полиморфные маркеры в гене TLR2 были определены в клиническом материале с помощью ПЦР, полиморфный маркер в гене TLR9 был определен с помощью ПЦР в режиме реального времени. Показано, что аллель Arg полиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 был ассоциирован с внутриутробной инфекцией. Другой аллель А полиморфного маркера A2848G гена TLR9 ассоциирован со срочными родами при урогенитальной инфекции.

В работе с уммированы материалы о роли Toll-подобных рецепторов (TLR) и их лигандов в патогенезе атеросклероза. Бактериальные липополисахариды (ЛПС), могут взаимодействуя с TLR4, могут индуцировать формирование атеросклеротических повреждений в артериальной стенке. Риск развития атеросклероза снижается при мутационном повреждении TLR4. Другие микробные лиганды и белки теплового шока также могут принимать участие в индукции атеросклероза. Предложена единая теория атерогенеза, согласно которой индукция и прогрессирование атерогенеза является побочным эффектом взаимодействия экзогенных и эндогенных лигандов с TLR .

В работе изучалась TLR-опосредованная функциональная активность мононуклеарных клеток периферической крови детей с различными формами нейтропении. Авторами установлено, что лиганды TLR2, TLR4, TLR5 обладали повышенной стимулирующей активностью на продукцию ФНОα МНК детей с врожденной нейтропенией и не влияли на МНК детей с иммунной нейтропенией. У детей с иммунной формой нейтропении выявили значительное повышение стимулированной выработки ИФНα в ответ на лиганды TLR3, TLR8 и TLR9. Авторы считают, что выявленные изменения TLR-опосредованной функциональной активности МНК у детей с различными формами нейтропении могут иметь существенное значение в развитии и течении инфекций у этих больных.

В работе определялась экспрессия TLR в селезенке и лимфатических узлах мышей при мукозальных методах иммунизации. Иммунизацию мышей поликомпонентной вакциной Иммуновак проводили мукозально и подкожно. На основе полученных данных авторы полагают, что различная степень сенсибилизации при разных путях введения одних и тех же препаратов предопределена уже на этапе взаимодействия лиганда с TLR.

В работе изучалось значение экспрессии TLR для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия. После лечения нуклеосперматом натрия было зарегистрировано повышение частоты клеток, экспрессирующих TLR4 и TLR9 типов в исследуемом материале, а также снижение количества вируса папилломы человека высокого онкогенного риска.

В работе изучалось влияние ингибитора циклооксигеназы – лорноксикама на опосредованную TLR выработку провоспалительных и противовоспалительных цитокинов мононуклеарами периферической крови здоровых доноров и больных с острым панкреатитом. Показано, что лорноксикам ингибирует TLR-опосредованную выработку как провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, 6, 8, 12, ФНОα), так и противовоспалительного цитокина ИЛ-10 этими клетками. Применение лорноксикама у больных с острым панкреатитом на начальном этапе заболевания приводило к снижению выработки ФНОα мононуклеарами периферической крови в ответ на ЛПС и, следовательно, к снижению эффекторных функций TLR4 и TLR1/2 у этих больных, что уменьшает риск развития осложнений.

Определение экспрессии TLR и их функцио­нальной активности является начальным этапом в оценке системы TLR у человека. Для получения полной информации о функционировании систе­мы TLR необходима комплексная оценка всех ее звеньев. Подобный подход был сформулирован ра­нее для оценки иммунного статуса по патогенети­ческому принципу: предлагалось оценивать различные этапы функционирования иммунной сис­темы . Дальнейшие этапы оценки системы TLR должны включать анализ всех остальных компо­нентов системы TLR: оценку экспрессии молекул, участвующих в трансдукции сигнала, факторов транскрипции и т. д. Это позволит уточнить и ло­кализовать молекулярные дефекты нарушений в системе врожденного иммунитета, а также оценить их роль в патогенезе широкого круга заболеваний.

Большой вклад в изучении этой проблемы могут внести экспериментальные исследования с использованием трансгенных и генно-нокаутированных мышей с различными генными дефектами для того, чтобы лучше определить влияние экспрессии и полиморфизма TLR на предрасположенность к различным, в том числе инфекционным заболеваниям. Представляет также определенный интерес изучение индивидуальных путей, в которых используются специфические адаптерные белки для каждого TLR, так как это должно расширить наши представления о реакциях организма на различные лиганды TLR .

Литература

1. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета. Иммунология 2005; 26 (6) : 368-376.
2. Werling D., Jungi T.W. TLR liking innate and adaptive immune response. Vet. Immunol. Immunopathol. 2003; 91 : 1-12
3. Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F. et al. Recognition of commensal microflora by TLRs is required for intestinal homeostasis. Cell 2004; 118 : 229-241.
4. Zarember K., Godowski P. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leucocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunology 2002; 168 :554-561.
5. Harter L., Mica L., Stocker R. et al. Shock, 2004, 5 : 403-409.
6. Li Liwu Curr. Drug Targets-inflamm. Allergy, 2004, 3 : 81-86.
7. Vandenbulcke L., Bachert C., Cauwenberge P.V. et al. Int. Arch. Allergy Immunol., 2006, 139 : 159-165.
8. Picard C., Puel A., Bonnet M. et al. Science, 2003, 299 : 2076-2079.
9. Л.В.Ковальчук, М.В.Хореева и др. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке TLR человека. Иммунопатология и клиническая иммунология 2008, 223-227.
10. М.З.Саидов, Х.Ш.Давудов и др. Экспрессия TLR в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом. Иммунология, 2008, 5 : 272-278.
11. В.А.Алешкин, А.В.Караулов и др. Связь уровней мРНК TLR2 и TLR4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин.
12. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы. Физиол. и патол. Иммунной системы, 2008, 6: 3-28.
13. Pitzurra L., Bellocchio S., Nocentini A. et al. Antifungal immune reactivity in nasal polyposis. Infect. And Immun., 2004, 12 : 7275-7281.
14. Wang J., Matsukura S., Watanabe S. et al. Involvement of TLRs in the immune response of nasal polyp epithelial cells. Clin. Immunol., 2007, 3 : 345-352.
15. Huvenne W., van Bruaene N., Zhang N. et al. Chronic rhinosinusutis with and without nasal polyps: what is the difference? Curr. Allergy Asthma Rep., 2009, 3: 213-220.
16. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Значение функциональной активности Толл-подобных рецепторов и других рецепторов врожденной иммунной системы в физиологии почек. Российский физиологический журнал, 2007, 5: 505-520.
17. Мedzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of immune response. Nature, 2007, 18: 819-826.
18. Uematsu S., Akira S. TLRs and innate immunity. J. Mol. Med. 2006, 84: 712-725.
19. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека. Иммунология, 1990, 3 : 4-7.
20. Катунин О.Р., Резайкина А.В., Колыханова О.И. «Роль распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления в коже больных псориазом». Вестник дерматологии и венерологии, 2010, 5 : 84-91.
21. Ганковская О.А. «Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов TLR2 и TLR9 с преждевременными родами и внутриутробным инфицированием». Медицинская иммунология, 2010, 1-2: 87-94.
22. Глинцбург А.Л., Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. «Экзогенные и эндогенные факторы в патогенезе атеросклероза. Рецепторная теория атеросклероза». Российский кардиологический журнал 2010, 2 : 92-96.
23. Мамедова Е.А., Ковальчук Л.В., Финогенева Н.А., Половцева Т.В., Грачева Л.А., Голдырева Н.Г., Хорева М.В., Фетисова Л.Я., Никонов А.С. Опосредованная TLR функциональная активность мононуклеарных клеток у детей с нейтропениями. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010, 2 : 64-68
24. Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Ахматов Э.А., Курбатова Е.А., Семенова И.Б., Чертов И.В., Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Экспрессия TLR в селезенке и лимфатических узлах при мукозальных методах иммунизации. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010, 1 : 50-54.
25. Прошин С.Н., Глушаков Р.И., Шабанов П.Д, Сайковская Л.А., Семенова И.В., Тапильская Н.И. Значение экспрессии TLR для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2011, 6(1): 91-97.
26. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Никонова А.С., Греченко В.В., Агапов М.А., Индраков В.А., Леоненко И.В., Горский В.А., Грачева Л.А. Корригирующее действие ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояние мононуклеарных клеток, экспрессирующих TLR. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010,1 :45-50.

Кейбір аурулар кезінде Толл-тәрізді рецепторлардың экспрессиясын зерттеу

5. Гуморальные факторы врожденного иммунитета (белки системы комплемента, белки острой фазы, белки теплового шока, цитокины, антимикробные пептиды и др.)

6. Цитокиновая сеть. Классификация и функция цитокинов.

7. Эндоцитозные, сигнальные и растворимые рецепторы врожденного иммунитета.

8. Секреторные рецепторы врожденного иммунитета.

9. Система комплемента

10. Роль белков теплового шока и острой фазы.

11. Характеристика антимикробных пептидов и их продуцентов.

12. Интерфероны, природа. Способы получения и применения.

13. Роль и. И. Мечникова в формировании учения об иммуните­те. Неспецифические факторы защиты организма.

14. Клеточные факторы врожденного иммунитета (макрофаги, нейтрофилы, естесственные киллеры, дендритные клетки, тучные клетки, базофилы, nk и др.).

15. Фагоцитоз (стадии фагоцитоза, кислородный взрыв и др.)

16. Функции естественных киллеров.

17. Мембранные и цитозольные рецепторы врожденного иммунитета (tlr, nlr, rig). См. Ответ 7.

18. Классификация и характеристика дендритных клеток.

21. Антигены микробов и клеток человека (cd, mhc). Гаптены

22. Характеристика Th1, Th2, Th17 и Treg-лимфоцитов.

23. Иммунокомпетентные клетки; t- и в-лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки.

25. Презентация антигена. Кооперация, основные принципы дифференцировки т- и в-лимфоцитов.

26. Формы иммуного ответа. Регуляция иммунного ответа.

27)Теории иммунитета. Генетика формирования т и в-клеточных рецепторов.

28) Иммунологическая толерантность,механизмы

29)Клеточный иммунный ответ (цитотоксический и воспалительный иммунный ответ, роль цитокинов, т-хелперов и макрофагов)

30)Гуморальный иммунный ответ (роль цитокинов, Th-2лимфоцитов и в-лимфоцитов).

31) Антитела. Классы, структура и функции иммуноглобулинов.

32) Антигенные свойства иммуноглобулинов, изотипы, аллотипы, идиотипы. Полные и неполные антитела.

33) Моноклональные антитела.Получение(гибридомная технология) и применение.

34) Генетика антителообразования.

35) Иммунологическая память. Первичный и вторичный ответ.

36) Мех-мы противоинфекционного (противобактериального и противовирусного) иммунитета

37) Мех-мы противогельминтного, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета.

38)Гиперчувствительность немедленного типа. Мех-мы возникновения,клиническая значимость.

39) Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причины возникновения.Механизм.Их предупреждение.Аллергоспецифическая иммунотерапия.

40. Механизм гиперчувствительности замедленного типа. Клинико-диагностическое значение

44. Оценка иммунного статуса: основные показатели и методы их определения.

45. Механизмы развития аутоиммуных реакций.

46. Практическое использование серологических реакций.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

50. Реакция пассивной гемагглютинации. Компоненты. Применение.

51. Реакция коагглютинации. Механизм, компоненты. Применение.

53. Реакция преципитации

54. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

55. Реакция связывания комплемента

56. Реакция нейтрализации

57. Реакция иммунофлюоресценции (риф,методКунса)

58. Иммуноферментный метод или анализ

59. Иммунная электронная микроскопия

60. Проточная цитометрия

61. Серологические реакции, используемые для диагнос­тики вирусных инфекций.

62. Диагностикумы. Получение, применение.

63. Моноклональные антитела. Получение, применение.

64 Методы приготовления и применения агглютинирую­щих, адсорбированных сывороток.

65 Вакцины

4.2.5.1. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины

6. Цитокиновая сеть. Классификация и функция цитокинов.

Цитокины - группа растворимых клеточных пептидных медиаторов, продуцирующихся разными клетками организма и играющих важную роль в обеспечении физиологических процессов в норме и при патологии.

Свойства цитокинов:

полипептиды средней ММ (< 30 кД)

регулируют силу и продолжительность реакций иммунитета и воспаления

секретируются локально

действуют как паракринные и аутокринные факторы

свойство избыточности (одни и те же цитокины вырабатываются разными клетками)

взаимодействуют с высокоаффинными рецепторами к цитокинам на мембранах клеток

плейотропность (одни и теже цитокины действуют на различные клетки-мишени)

каскадность («цитокиновая сеть»)

синергизм, антагонизм

Классификация цитокинов:

Интерлейкины (ИЛ1-ИЛ18) – секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторные взаимодействия в иммунной системе и связь ее с другими системами организма.

Интерфероны (ИФНα,β,γ) – противовирусные агенты с выраженным иммунорегуляторным действием.

Факторы некроза опухолей (ФНОα,ФНОβ) – цитокины с цитотоксическим и регуляторным действием.

Факторы роста (ФРФ, ФРЭ, ТФР β) – регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток.

Колониестимулирующие факторы (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ) – стимуляторы роста и дифференцировки гемопоэтических клеток.

Хемокины (RANTES, MCP-1, MIP-1a) – хемоаттрактанты для лейкоцитов.

Классификация цитокинов по биологической активности:

Цитокины – регуляторы воспалительных реакций:

провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα, ИФНγ, МИФ)

противовоспалительные (ТРФβ, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-13).

Цитокины – регуляторы клеточного антигенспецифического иммунного ответа (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-10, ИФНγ, ТРФβ).

Цитокины – регуляторы гуморального антигенспецифического иммунного ответа(ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, ИФНγ, ТРФβ).

7. Эндоцитозные, сигнальные и растворимые рецепторы врожденного иммунитета.

Особую роль в реакциях врожденного иммунитета играют паттернраспознающие рецепторы (PRR, особенно Toll-подобные рецепторы - TLR), распознающие компоненты микроорганизмов и эндогенные сигналы опасности, которые возникают в организме. В результате действия высокоэффективных механизмов врожденная иммунная система определяет потенциальные патогены, распознавая ЛПС, пептидогликаны, липопептиды, флагеллин и многие другие консервативные и неизменяющиеся структурные молекулы.

В этом отношении врожденную иммунную систему рассматривают как первую линию защиты против патогенных микроорганизмов у млекопитающих. Одна из целей врожденного иммунитета сводится к раннему установлению различий между патогенами и непатогенами, что особенно важно в пограничных тканях (слизистые оболочки пищеварительного тракта и дыхательных путей, кожа и т.д

Рецепторы опознавания паттерна классифицируют по специфичности к лиганду, функции, локализации и по происхождению в эволюции. По функции они делятся на два класса: сигнальные и эндоцитозные.

Сигнальные рецепторы опознавания паттерна включают, например, толл-подобные рецепторы.

Эндоцитозные рецепторы опознавания паттерна , например, маннозные рецепторы макрофагов, необходимы для прикрепления, поглощения и процессирования микроорганизмов фагоцитами независимо от внутриклеточной передачи регуляторного сигнала. Кроме патогенов они опознают также апоптозные клетки.

Мембранные рецепторы опознавания паттерна

Рецепторы-киназы

Впервые рецепторы опознавания паттерна были открыты у растений . Позже множество гомологичных рецепторов было обнаружено при анализе геномов растений (у риса 370, у Arabidopsis - 47). В отличие от рецепторов опознавания паттерна у животных, которые связывают внутриклеточные протеинкиназы с помощью адапторных белков, растительные рецепторы представляют собой один белок, состоящий из нескольких доменов, внеклеточного, опознающего патоген, внутриклеточного, обладающего киназной активностью, и трансмембранного, связывающего первые два.

Толл-подобные рецепторы

Этот класс рецепторов опознает патогены вне клеток или в эндосомах . Они были впервые обнаружены у дрозофилы и индуцируют синтез и секрецию цитокинов, необходимых для активации иммунного ответа. В настоящее время толл-подобные рецепторы обнаружены у многих видов. У животных их насчитывают 11 (TLR1-TLR11). Взаимодействие толл-подобных рецепторов с лигандами приводит к индукции сигнальных путей NF-kB и МАР-киназы, которые, в свою очередь, индуцируют синтез и секрецию цитокинов и молекул, стимулирующих презентацию антигена .

Цитоплазматические рецепторы опознавания паттерна

Nod-подобные рецепторы

Nod-подобные рецепторы - это цитоплазматические белки с различными функциями. У млекопитающих их найдено около 20, и большинство из них подразделяют на два главных подсемейства: NOD и NALP. Кроме того, к этому семейству рецепторов относят трансактиватор главного комплекса гистосовместимости класса II и некоторые другие молекулы. Опознавая патоген внутри клетки, рецепторы олигомеризуются и образуют инфламмасому, активирующую ферменты протеолитической активации цитокинов, например, интерлейкина 1 бета. Рецепторы активируют также сигнальный путь NF-kB и синтез цитокинов .

Известны два главных представителя: NOD1 и NOD2. Связывают два разных бактериальных пептидогликана .

Известно 14 белков (NALP1 - NALP14), которые активируются бактериальными пептидогликанами, ДНК, двухцепочечной РНК, парамиксовирусом и мочевой кислотой. Мутации некоторых из NALPS являются причиной наследственных аутоиммунных заболеваний.

Другие Nod-подобные рецепторы

Такие молекулы, как IPAF и NAIP5/Birc1e также индуцируют протеолитическую активацию цитокинов в ответ на появление сальмонеллы и легионеллы.

РНК хеликазы

Индуцируют антивирусный иммунный ответ после активации вирусной РНК. У млекопитающих это три молекулы: RIG-I, MDA5 и LGP2.

Секретируемые рецепторы опознавания паттерна

Многие рецепторы опознавания паттерна, например, рецепторы комплемента, коллектины и пентраксины, к которым, в частности, относится C-реактивный белок, не остаются в синтезирующей их клетке и попадают в сыворотку крови . Одним из важнейших коллектинов является лектин, связывающий маннозу; он опознает широкий спектр патогенов, в состав клеточной стенки которых входит манноза, и индуцирует лектиновый путь активации системы комплемента .

УДК 571.27; 578.224

^лл-подобные рецепторы (TLR) и их значение в опухолевой прогрессии

Д. В. Щебляков, Д. Ю. Логунов*, А. И. Тухватулин, М. М. Шмаров, Б. С. Народицкий,

А. Л.Гинцбург

ФБГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 28.08.2010 г.

РЕФЕРАТ Толл-подобные рецепторы (TLR) являются главными компонентами системы врожденного иммунитета, которые опосредуют специфическое распознавание эволюционно консервативных молекулярных структур патогенов (PAMP - pathogen associated molecular patterns). Толл-подобные рецепторы представлены на клетках разного типа - от эпителиальных до иммунокомпетентных. Как известно, при связывании TLR с собственными лигандами происходит активация ряда адаптерных белков и киназ, которые участвуют в индукции ключевых провоспалительных факторов. Итогом такой индукции является развитие как врожденного иммунного ответа в результате усиления экспрессии ряда антиапоптотических белков, провоспалительных цитокинов, антибактериальных белков, так и приобретенного иммунного ответа через созревание дендритных клеток, презентации антигена и т.д. Благодаря своей способности усиливать специфические и неспецифические иммунные реакции организма агонисты Толл-подобных рецепторов нашли применение не только в терапии инфекционных заболеваний, но также в качестве адъювантов в химиотерапии различных злокачественных новообразований. Однако к настоящему моменту описаны принципиально различные эффекты TLR на опухоли. С одной стороны, показано, что TLR (и их лиганды) могут выступать в роли супрессоров опухолевого роста, с другой стороны, TLR могут стимулировать опухолевую прогрессию и влиять на устойчивость опухолей к химиотерапии. В представленном обзоре обобщены данные о влиянии TLR и их агонистов на рост опухоли, а также проанализированы основные механизмы, лежащие в основе таких различий.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Толл-подобные рецепторы, агонисты рецепторов врожденного иммунитета, опухоль, врожденный иммунный ответ, воспаление.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ TLR - Толл-подобные рецепторы; ЛПС - липополисахарид; NF-kB - ядерный фактор транскрипции kB; PRR - паттерн-распознающие рецепторы; PAMP - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны; DAMP - молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением; IRF -интерферонрегулирующий фактор, оц- и дцРНК - одно- и двухцепочечная рибонуклеиновая кислота; TNF-a - фактор некроза опухоли a; IL - интерлейкин; IFN - интерферон; NK-клетки - естественные киллеры; миРНК - малые интерферирующие РНК; TGF - трансформирующий фактор роста.

ВВЕДЕНИЕ ческим фактором, активирующим экспрессию генов

По современным представлениям воспаление явля- ряда антиапоптотических белков, таких, как IAP,

ется одной из главных причин возникновения и про- Bcl-2, Bcl-XL и др. Присутствие этих белков увели-

грессии опухолевых заболеваний . Механизм чивает устойчивость клеток к различным стрессовым

этой взаимосвязи изучен недостаточно полно, но уже воздействиям, возникающим в ходе развития вос-

сегодня понятен ряд ключевых событий, происходя- паления .

щих в очаге воспаления и необходимых для возник- 2) Процесс воспаления сопровождается индукцией

новения и прогрессии опухоли. окислительного стресса - причине появления и на-

1) В клетках, находящихся в очаге воспаления, копления мутаций, а также генетических перестроек поддерживается стабильно высокая активность в клетках .

транскрипционного фактора NF-kB , ответствен- 3) На завершающих этапах воспаления секретиру-

ного за экспрессию провоспалительных цитокинов, ется большое количество провоспалительных цитомногие из которых (GROa,P,y, IL-8, MIP-3a) обла- кинов (GROa/CXCL1, GROP/CXCL2, GROy/CXCL3

дают опухолестимулирующим действием . Бо- и IL-8/CXCL8, MIP-3a, IL-1) и факторов роста

лее того, NF-kB считается основным антиапоптоти- (TGF-^1, PDGF, bFGF, TGF-a, IGF-I, IGF-II), ко-

торые усиливают миграцию в очаг воспаления клеток стромы (фибробластов) и эпителиальных клеток, а также их последующую пролиферацию . При хроническом воспалении процессы репарации и альтерации зачастую происходят одновременно, что заставляет клетки пролиферировать в условиях гипоксии и генотоксического стресса, повышая тем самым риск возникновения мутаций.

Наиболее частой и хорошо изученной причиной развития воспаления является микробная инвазия, в ходе которой патоген способен различными способами нарушать гомеостаз клетки хозяина.

Один из таких механизмов - взаимодействие высококонсервативных участков молекул патогена с эукариотической клеткой через паттерн-распознающие рецепторы (PRR - RIG-I-подобные рецепторы, Nod-подобные рецепторы, лектины C-типа, Толл-подобные рецепторы (TLR) и др.), расположенные на поверхности и/или внутри эукариотических клеток .

Связывая различные бактериальные лиганды, PRR играют ключевую роль в развитии воспаления, инициируя развитие как врожденного иммунного ответа (усиливают экспрессию ряда антиапоп-тотических белков, провоспалительных цитокинов, антибактериальных белков), так и приобретенного (индуцируют созревание дендритных клеток, презентацию захваченного антигена, дифференцировку наивных Т-хелперов) .

В связи с этим становится актуальным изучение роли PRR в индукции опухолеобразования и стимуляции опухолевой прогрессии при развитии бактериальной инфекции.

В данном обзоре мы остановим внимание на роли TLR в развитии воспалительных реакций и попытаемся оценить их взаимосвязь с опухолевой прогрессией.

Сегодня накоплены данные, свидетельствующие о том, что TLR ассоциированы с опухолевым ростом. Однако к настоящему моменту опубликованы противоречивые данные, подтверждающие как опухолестимулирующее , так и опухоле-супрессирующее действие TLR .

В связи с этим целью нашего обзора является систематизация имеющихся данных и описание возможных механизмов, обусловливающих различия в проявляемых эффектах TLR на рост опухоли.

функция KR

TLR по выполняемым в организме функциям относят к семейству PRR, которые опосредуют специфическое распознавание эволюционно консервативных структур патогенов (PAMP - pathogen associated molecular patterns). Связываясь с РАМР, TLR активируют систему врожденного иммунитета и во многом определяют развитие адаптивного иммунитета . Наиболее консервативная роль TLR - активация антимикробного иммунитета в коже, слизистых оболочках респираторного, гастроинтестинального и урогенитального тракта.

TLR распознают микробные молекулы, что приводит к развитию воспалительных реакций, вызванных активацией фактора NF-kB, который регулирует экспрессию провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-1, IL-6 и др.) и хемокинов (MCP-1, MCP-3, GM-CSF и др.).

TLR вовлечены в транскрипционную и посттран-сляционную регуляцию (протеолитическое расщепление и секрецию) таких антимикробных факторов, как дефензины (а и в), фосфолипаза А2, лизоцим и др. . TLR усиливают поглощение микроорганизмов фагоцитами и оптимизируют их инактивацию, регулируя выброс перекисных радикалов и оксида азота .

Известно, что TLR, находящиеся на поверхности эндотелиальных клеток, опосредованно обеспечивают миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, стимулируя экспрессию молекул адгезии лейкоцитов -Е-селектина и ICAM-1 .

Стимуляция TLR прямо ведет к увеличению продукции интерферонов (IFN)-a/p как стромальными, так и гемопоэтическими клетками, что важно для защиты организма от вирусных и некоторых бактериальных инфекций . Более того, недавно было установлено, что TLR, активируя ряд молекул (FADD, каспаза 8, протеинкиназа R (PKR)) или стимулируя экспрессию IFN-а/в, могут индуцировать развитие апоптоза - важного механизма, защищающего клетки от патогенных микроорганизмов .

Показано, что TLR играют центральную роль в регуляции адаптивного иммунного ответа. Так, TLR-зависимая активация профессиональных анти-генпредставляющих дендритных клеток является определяющим моментом в нескольких принципиальных для развития адаптивного иммунитета процессах: активации зрелых T-клеток; процессинга и презентации микробных антигенов; повышении экспрессии костимуляторных молекул (CD80, CD86), необходимых для активации наивных CD4 + -T-клеток; подавлении регуляторных T-клеток посредством продукции IL-6 . Также известно, что TLR-зависимая активация важна для пролиферации и созревания В-клеток во время инфекции .

Таким образом, TLR выполняют в организме важную роль, которая заключается в развитии воспалительных реакций (активации врожденного иммунитета) в ответ на попадание в организм самых различных патогенов (простейших, грибов, бактерий, вирусов). Более того, по современным представлениям распознавание патогенов посредством TLR является ключевым моментом в формировании второй

линии защиты - адаптивного иммунитета . Также показано, что TLR принимают участие в нормальном функционировании кишечника, они вовлечены в развитие аутоиммунных заболеваний (системная волчанка), артритов, атеросклероза и др. . В последнее время получены данные, которые показывают, что TLR способны активировать противоопухолевый иммунитет или, наоборот, стимулировать опухолевую прогрессию .

СТРУКТУРА TLR, ИХ ЭКСПРЕССИЯ РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ КЛЕТОК, СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАЗЛИЧНЫМ МОЛЕКУЛЯРНЫМ СТРУКТУРАМ (PAMP И DAMP)

По своей структурной организации TLR относятся к семейству рецепторов IL-1 (IL-1R). TLR - это трансмембранные белки, которые экспрессируются на поверхности клетки и в субклеточных ком-партментах (таких, как эндосомы). Локализация TLR связана с типом распознаваемого им лиганда. Так, TLR 1, 2, 4, 5, 6, связывающие структурные бактериальные компоненты, локализуются на поверхности клеток, тогда как TLR 3, 7, 8, 9, распознающие преимущественно вирус-ассоциированные структуры - нуклеиновые кислоты (дцРНК, оцРНК, ДНК), находятся в эндосомах, где взаимодействуют с лигандами после депротеинизации ви-рионов .

В структуре TLR выделяют N-концевой лейцин-богатый (LRR) домен, ответственный за связывание лигандов, трансмембранный домен и С-концевой внутриклеточный сигнальный домен (гомологичный внутриклеточному домену IL-1R) .

TLR экспрессируются в большинстве типов клеток организма человека, включая негемопоэтиче-ские эпителиальные и эндотелиальные клетки. Количество одновременно экспрессируемых TLR и их сочетание специфичны для каждого типа клеток,

а больше всего TLR в клетках гемопоэтического происхождения, таких, как макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки (табл. 1) .

В настоящий момент у млекопитающих идентифицировано 13 различных TLR, у человека - 10 и 12 у мышей. TLR с 1-го по 9-й консервативны у человека и мыши. Однако существуют и различия. Ген, кодирующий TLR10, обнаружен только у человека, а TLR11 - у обоих видов, но функционален только у мышей .

Главная особенность TLR, отличающая их от рецепторов приобретенного иммунитета (T- и В-клеточные рецепторы), состоит в их способности распознавать не уникальные эпитопы, а эволюционно консервативные патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP), широко представленные у всех классов микроорганизмов и вирусов независимо от их патогенности.

Специфичность распознавания PAMP достаточно хорошо изучена у большинства TLR, сегодня известны лиганды TLR 1-9 и 11 (рис. 1). Биологическая роль и специфичность TLR10 (человек), 12 и 13 (мышь) остаются неизвестными .

Наиболее известные микробные лиганды TLR:

Бактериальные липопептиды, липотейхоевая кислота и пептидогликаны; липоарабидоманнан микобактерий; компонент клеточной стенки грибов зи-мозан, которые связываются с TLR2, образующим гетеродимеры с TLR1, TLR6 и CD14;

ЛПС грамотрицательных бактерий, лиганд TLR4;

Компонент жгутиков бактерий - флагеллин, активирующий TLR5;

Профиллин-подобные структуры простейших, связывающиеся с TLR11;

ДНК (неметилированные CpG-последовательности), распознаваемая TLR9;

ДцРНК - лиганд TLR3;

ОцРНК - лиганды TLR7 и TLR8.

Рис. 1. Толл-подобные рецепторы и их лиганды.

Бактериальные компоненты

Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи)

T. gondi ЛПС Флаггелин Профиллин

TLR4 =TLR5 =TLR11

Вирусные компоненты

Неметили-

рованная

CpG ДНК дцРНК оцРНК

ÜTLR9 =TLR3 =TLR7

Недавно было показано, что TLR могут активироваться многими эндогенными молекулами - ал-ларминами (гиалуроновая кислота, белки теплового шока и др.), которые появляются при разрушении тканей. Эти гетерогенные по своей природе и структуре соединения (PAMP и аллармины), распознаваемые TLR, в настоящее время объединяют в одно семейство, именуемое DAMP (damage associated molecular patterns) .

КАСКАД СИГНАЛОВ, АКТИВИРУЮЩИЙСЯ ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ TLR С СОБСТВЕННЫМИ ЛИГАНДАМИ

Теперь от описания структуры и функций TLR перейдем к событиям, разворачивающимся после их связывания с собственными лигандами.

Связывание лиганда с TLR инициирует каскад сигналов, берущих начало от цитоплазматических TIR-доменов TLR. Сигнал от TIR-домена через адап-терные молекулы MyD88 (myeloid differentiation factor 88), TIRAP (TIR-доменсодержащие адаптеры), TICAM1 (TRIF), TICAM2 (TIR-containing adaptеr molecule) передается на соответствующие киназы (TAK, IKK, TBK, MAPK, JNKs, p38, ERK, Akt и др.), которые дифференциально активируют факторы транскрипции (NF-kB, AP-1 и IRF), ответственные за экспрессию различных провоспалительных и антимикробных факторов. При этом все TLR, кроме TLR3, передают сигнал на киназы, используя MyD88. TLR3 передает сигнал через TICAM1, a TLR4 и через MyD88, и через TICAM1 (рис. 2).

Активация того или иного фактора определяется типом TLR, от которого передается сигнал. Так, практически все TLR (TLR2 и его корецепторы -TLR1 и TLR6, а также TLR4-9, TLR11), связываясь с собственными лигандами, способны активировать NF-kB - один из основных факторов, регулирующих экспрессию таких провоспалительных цито-кинов, как IL-1, -6, -8 и др. К активации другого семейства провоспалительных транскрипционных факторов - IRF приводит передача сигнала через TLR3, 4, 7-9. Сигналы, передаваемые через TLR3 или TLR4, ведут к активации IRF3, который регулирует экспрессию IFN-ß и считается критическим компонентом противовирусных иммунных реакций. Передача сигналов посредством TLR7-9 ведет к активации IRF5 и IRF7 и экспрессии IFN-a, который также играет жизненно важную роль в противовирусной защите. Сигнализация через TLR2 или TLR5 не ведет к активации факторов семейства IRF .

Таким образом, взаимодействие TLR определенного типа с собственным лигандом инициирует запуск сигнального каскада, который приводит к активации

Таблица 1. Активация транскрипционных факторов NF-kB и IRF различными ^R

^п TLR Активация NF-kB Активация IRF

TLR7 + + (IRF5, 7)

TLR8 + +(IRF5, 7)

TLR9 + +(IRF5, 7)

экспрессии специфического сочетания генов (цито-кинов, антимикробных молекул и т.д.).

Однако в настоящее время многое в активации TLR-зависимых сигнальных путей и в развитии последующих эффектов остается непонятным. В доступной научной литературе отсутствуют данные, характеризующие полные транскриптомные и про-теомные изменения, которые происходят в ответ на активацию определенных TLR.

TLR И ОПУХОЛИ

К настоящему моменту описаны принципиально различные эффекты TLR на опухоли. С одной стороны, показано, что TLR (и их лиганды) могут выступать в роли супрессоров опухолевого роста, с другой, известно, что TLR могут стимулировать опухолевую прогрессию и влиять на устойчивость опухолей к химиотерапии. Чтобы объяснить эти противоречия, рассмотрим детально каждый из случаев.

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ TLR

Многие агонисты TLR в настоящее время проходят клинические испытания в качестве противоопухолевых средств (табл. 2). Так, природные (оцРНК) и синтетические (имиквимод) агонисты TLR7 и 8 показали высокую активность в отношении хронического лимфоцитарного лейкоза и опухолей кожи . Лиганд TLR9 - cpG, способен подавлять рост лимфом, опухолей головного мозга, почек, кожи . А лиганд TLR3 - poly(IC) обладает проапоптотическим действием не только в отношении опухолевых клеток, но и клеток окружения (например, эндотелия) .

Показано, что агонисты TLR4 - ЛПС грамотрица-тельных бактерий и ОК-432 (препарат из стрептококков группы А), обладают высокой противоопухолевой активностью при внутриопухолевом введении. Однако при системном введении оба препарата (ЛПС и ОК-432) не обладали способностью блокировать опухолевый рост . В настоящее время препарат ОК-432 проходит вторую стадию клинических испытаний, в качестве средства против колоректальных опухолей

Рис. 2. Сигнальные пути, идущие от Толл-подобных рецепторов.

Плазматическая мембрана

Эндосома

Внеклеточный домен

Трансмембранный домен

липопептид

и рака легкого. Также показано, что ОМ-174, химический агонист ^И2/4, способен подавлять прогрессию меланомы и повышать выживаемость экспериментальных животных при совместном введении с цикло-фосфамидом . В этих экспериментах обнаружено, что агонисты TLR2/4 индуцируют секрецию TNF-a и экспрессию индуцибельной ПО-синтазы. Как известно, N0 способен индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, устойчивых к химиотерапии, и тем самым повышать продолжительность жизни мышей. Еще один известный противоопухолевый препарат микробного происхождения, активирующий ^Г-зависимые реакции (TLR2, 4, 9), - БЦЖ. Этот препарат уже более 30 лет относительно успешно применяется в терапии опухолей мочевого пузыря .

Таблица 2. TLR в клинических исследованиях

В целом, необходимо отметить, что в настоящее время различные агонисты TLR проходят клинические испытания как средства против опухолей различного происхождения (табл. 2).

Один из основных механизмов противоопухолевой активности TLR состоит в их способности стимулировать развитие опухолеспецифического иммунного ответа. Так, активация ^Г:

1) стимулирует (прямо или опосредованно) миграцию в опухоль ПК-клеток, цитотоксических Т-клеток и Т-хелперов 1-го типа, которые вызывают лизис опухолевых клеток при помощи различных эффекторных механизмов (секреция перфоринов, гранзимов, №N-7 и др.) ;

2) приводит к секреции I типа (№П-а, в) .

Злокачественное образование

Немелкоклеточный рак легкого поздней стадии ^И9

Меланома IV стадии

Меланома ШЬ/с, или IV стадии

Неполностью операбельный рак поджелудочной железы ^И2/6

Рецидив неходжкинской лимфомы

Рецидив глиобластомы

Хронический лимфобластный лейкоз ^И7

Таблица 3. Влияние ^R на развитие и рост опухоли

Опухолестимулирующая активность TLR Противоопухолевая активность TLR

Стимуляция ангиогенеза 2, 9 Подавление ангиогенеза 7, 9

Стимуляция пролиферации 3, 4 Развитие апоптоза 3, 4, 7, 9

Химиорезистентность 4 Повышение химиочувствительности 2, 4, 7

Активация регуляторных Т-клеток (Treg) 4, 5 Ингибирование Treg, презентация антигена 4, 5, 7, 8, 9

Цитотоксичность 9

Еще один вероятный механизм противоопухолевой активности TLR - возможность TLR-зависимого перехода опухолестимулирующего типа макрофагов (М2) в опухолесупрессирующий тип M1. Макрофаги типа М2 характеризуются экспрессией таких цито-кинов, как TGF-ß и IL-10, компонентов, необходимых для репарации и ремоделирования тканей. TGF-ß стимулирует пролиферацию опухолевых клеток, IL-10 направляет развитие иммунного ответа в сторону Th2, блокируя тем самым развитие клеточного противоопухолевого иммунитета. Макрофаги типа М1, напротив, экспрессируют IL-1, -6, -12, TNF-a, IFN-y и стимулируют развитие противоопухолевого клеточного (Th1) иммунного ответа .

ОПУХОЛЕСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ TLR

Как известно, хронические инфекции и воспаление являются важнейшими факторами, стимулирующими развитие злокачественных новообразований. В частности, рак желудка может быть связан с хроническим воспалением, вызванным таким патогеном, как Helicobacter pylori, а хроническое воспаление пищеварительного тракта часто ассоциировано с развитием рака толстой кишки . Более того, показано, что применение нестероидных противовоспалительных препаратов может снижать риск развития некоторых типов злокачественных новообразований .

TLR служат ключевым звеном системы врожденного иммунитета человека и животных, они участвуют в развитии воспалительных реакций при контакте клеток с различными патогенами. В настоящее время активно изучается роль TLR в развитии и прогрессии опухолей различного происхождения. TLR могут быть вовлечены в процесс развития и стимуляции опухолеобразования посредством нескольких механизмов (табл. 3).

Один из важнейших факторов, обусловливающих взаимосвязь хронического воспаления и опухоле-образования - NF-kB . Этот фактор конститутивно активирован более чем в 90% опухолей человека, включая острый и хронический миелоидный лейкоз, рак предстательной железы, множественную миело-му, злокачественную гепатому (рак печени) и т.д. . В связи с этим агенты, способные активировать NF-kB, могут непосредственно участвовать в процессе развития и прогрессии опухоли. Как известно, взаимодействие патогенов с TLR на поверхности клетки приводит к активации NF-kB и экспрессии NF-kB-зависимых генов, что и обусловливает участие TLR в стимуляции канцерогенеза. Активация NF-kB приводит к повышению продукции цитоки-нов IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a; миграции клеток иммунной системы к месту воспаления в результате повышения продукции хемокинов; «поддержанию» хронического воспаления; повышению продукции антиапоптотических факторов и т.д. Указанные свойства могут обеспечивать выживаемость и прогрессию опухоли за счет подавления апоптоза и цитотоксичности, а также индукции ангиогенеза .

В настоящее время известно, что уровень TLR повышен в клетках различных опухолей, и у мышей с нокаутом генов ТLR снижена частота образования индуцируемых опухолей . Более того, повышение экспрессии TLR на поверхности клеток опухоли предстательной железы или опухоли головы и шеи может стимулировать их пролиферацию .

Huang и соавт. показали, что Listeria monocytogenes обладает прямым опухолестимулирующим действием, связанным с ее способностью активировать TLR2-зависимые сигнальные пути в клетках рака яичника. Более того, TLR2-зависимая активация NF-kB, вызванная L. monocytogenes, приводила к повышению устойчивости опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов . Взаимосвязь TLR2 с опухолевой прогрессией подтверждена в еще одном независимом исследовании, в котором Karin и соавт. доказали ключевую роль этого рецептора в метастазировании рака легкого. Оказалось, что у мышей с нокаутом гена TLR2 ме-тастазирование и прогрессия опухолей происходит значительно медленнее, чем у мышей дикого типа. Ключевую роль в прогрессии рака легкого играли миелоидные клетки, экспрессирующие TNF-a в ответ на их стимуляцию версиканом (протеогликаном внеклеточного матрикса, лиганда TLR2, уровень которого повышен в опухолевых клетках многих ти-

пов). В наших исследованиях также изучали роль TLR2 в опухолевой прогрессии. В частности, оказалось, что микоплазменная инфекция (Mycoplasma arginini) или добавление структурных компонентов (ЛАМБ) этого возбудителя к клеткам, экспрессирующим TLR2, приводит к подавлению в них апоптоза, а также к усилению опухолевого роста в условиях in vivo . Таким образом показано, что TLR могут оказывать опосредованный опухолестимулирующий эффект через клетки миелоидного ряда .

Сходные данные получены и для другого представителя семейства TLR - TLR4. Системное (внутривенное) введение лиганда этого рецептора -ЛПС, стимулировало миграцию опухолевых клеток (аденокарцинома молочной железы) и повышало их инвазивность, а также стимулировало ангиогенез в опухолях . Аналогичные результаты получены на другой модели - аденокарциноме кишечника: ЛПС увеличивал выживаемость клеток опухоли, стимулировал их пролиферацию, а при интрапери-тонеальном введении усиливал метастазирование . Более того, Huang и соавт. показали, что опухолевые клетки, экспрессирующие TLR4, вызывают значительно более агрессивное течение заболевания (сокращение времени жизни животных) по сравнению с мышами изогенной линии, у которых TLR4 инактивирован специфической миРНК. Полученные данные позволили предположить, что на прогрессию TLR4-позитивных опухолей могут влиять эндогенные лиганды (белки теплового шока; в-дефензины; эндогенный ЛПС, забрасываемый из кишечника), что отчасти напоминает ситуацию с опухолестимулирующим действием TLR2 и его лигандом эндогенного происхождения - версиканом .

Однако данные, иллюстрирующие опухолестимулирующее действие TLR, получены не только для TLR2 и 4. Известно, что повышенная экспрессия TLR5 и TLR9 на клетках эпителия шейки матки может быть ассоциирована с прогрессией рака шейки матки . Высокий уровень экспрессии TLR9 обнаружен в клинических образцах рака легкого и в линиях опухолевых клеток. В этих клетках стимуляция TLR9 специфическими агонистами приводила к повышению продукции опухоль-ассоциированных цитокинов . На поверхности клеток опухоли предстательной железы человека также повышен уровень TLR9 . Обработка таких клеток CpG-олигодезоксинуклеотидами (ODN-CpG) или бактериальной ДНК, служащих лигандами для TLR9, способствовала повышению инвазии опухолевых клеток. Повышение инвазии опухолевых клеток в результате активации TLR9 можно рассматривать как новый механизм, посредством которого хронические инфекции могут стимулировать рост клеток опухоли предстательной железы.

Однако способностью стимулировать канцерогенез через взаимодействие с TLR обладают не только различные инфекционные агенты и их структурные компоненты. Как известно, лигандами для TLR служат также DAMP - ядерные и цитоплазматические белки клеток, подвергшихся некрозу. Высвобождаемые из поврежденных клеток DAMP могут распознаваться различными TLR на поверхности иммунных клеток, а последующая активация TLR-зависимых сигналов способна приводить к подавлению противоопухолевого иммунного ответа и, как следствие, к стимуляции прогрессии опухоли .

К таким молекулам, обладающим потенциальным опухолестимулирующим действием, относятся: белки теплового шока (HSP60, 70), АТР и мочевая кислота, семейство Са2+-модулирующих белков (S100), белок HMGB1 и нуклеиновые кислоты, из которых наиболее хорошо изучен ДНК-связывающий белок HMGB1. Высвобождаемый в результате повреждения клеток белок HMGB1 активирует иммунную систему через взаимодействие с TLR. На культурах клеток показано, что белок HMGB1 стимулирует рост клеток меланомы, рака молочной железы, толстой кишки, поджелудочной и предстательной железы. HMGB1 способен активировать TLR2 и TLR4 на опухолевых клетках и клетках иммунной системы и, как следствие, индуцировать опухолевую прогрессию и метастазирование .

Показано, что в клетках меланомы повышена экспрессия таких DAMP, как белки семейства S100, способные стимулировать рост и самих клеток меланомы, и лимфоцитов периферической крови, действуя как аутокринный фактор роста опухоли. Белок S100A4, служащий лигандом для TLR, стимулирует метастазирование клеток рака молочной железы, а его повышенная экспрессия является показателем плохого прогноза. Несмотря на взаимосвязь S100A4 с метаста-зированием, этот белок может экспрессироваться макрофагами, лимфоцитами и фибробластами. Недавние исследования показали, что белки S100A8 и S100A9, продуцируемые первичной опухолью, способны активировать сывороточный амилоид А (SAA) 3 в легочных тканях и создавать тем самым условия для образования метастатической ниши. SAA3 служит лигандом для TLR4 на эндотелиальных клетках легкого и макрофагах. Активация TLR4 облегчает миграцию опухолевых клеток из первичного очага в ткань легкого за счет формирования микроокружения, способствующего росту опухоли. Таким образом, подавление сигнального пути S100-TLR4 может эффективно противодействовать образованию метастазов в легком .

Суммируя описанные эффекты, можно сделать вывод о способности TLR, с одной стороны, прямо или опосредованно участвовать в опухолевой про-

грессии, а с другой - повышать устойчивость опухолевых клеток к проапоптотическим воздействиям.

Представленные данные показывают, что опухолестимулирующие эффекты TLR и их лигандов имеют сложный механизм, который необходимо изучать более детально. Однако, несмотря на сложность данного вопроса, можно выделить несколько ключевых моментов, определяющих опухолестимулирующее действие TLR:

1) взаимодействие TLR с собственными лигандами индуцирует активацию транскрипционного фактора NF-kB и, как следствие, повышение продукции различных провоспалительных цитокинов (^-6, МСР-1, М№, GR0a и др.), а также ряда антиапоптотических белков, тем самым способствуя прямому или опосредованному опухолестимулирующему действию;

2) TLR-зависимая активация миелоидных клеток и их предшественников, по-видимому, является определяющим фактором в формировании метастазов. В серии независимых работ показано, что мие-лоидные клетки, мигрирующие из костного мозга (в ответ на эндогенную стимуляцию) в ткани, играют ключевую роль в формировании метастатических ниш . Поскольку известно, что эндогенные (версикан, фибронектин и др.) и экзогенные (микробного происхождения) лиганды TLR способны, с одной стороны, стимулировать миелоидные клетки и их предшественники, а с другой - увеличивать метастатический потенциал опухоли, то можно с высокой вероятностью предположить существование взаимосвязи между TLR-зависимой активацией миело-идных клеток и их последующим участием в мета-стазировании;

3) активация TLR может стимулировать ангиогенез через такие ангиогенные факторы, как ^-8, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и матрикс-ные металлопротеиназы (ММР), а также усиливать адгезивные и инвазивные свойства опухолевых клеток наряду с увеличением проницаемости сосудов.

ТОЛЛ-ПОДОБНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ

Благодаря способности агонистов ТLR индуцировать противоопухолевый иммунный ответ путем регуляции функции клеток иммунной системы, находящихся в микроокружении опухоли, перспективной представляется противоопухолевая терапия, основанная на доставке лигандов ТLR в очаги роста опухоли. Примером такой терапии может стать препарат имиквимод, содержащий агонист TLR7. Этот препарат используется при актиническом кератозе и базальноклеточной карциноме. Изучается также возможность использования этого препарата в качестве адъюванта в терапии мелано-

мы . Еще один агонист TLR7, используемый в терапии опухолей, - препарат 852А. В настоящее время рассматривается возможность использования препарата 852А в терапии хронического лимфоидного лейкоза и других солидных опухолей . Агонист TLR9 - 0DN-CpG, индуцирует активацию и созревание дендритных клеток, стимулирует развитие Т-клеточного противоопухолевого ответа. В настоящее время проводятся клинические испытания безопасности и эффективности агонистов TLR9 в терапии рака молочной железы, толстой кишки, легкого, меланомы, глиобластомы и др. . Макрофаг-активирующий липопептид-2 (MALP-

2), агонист TLR2/6, показал обнадеживающие результаты в терапии рака поджелудочной железы: внутриопухолевое введение MALP-2 совместно с гемцитабином во время лапоротомии значительно повышало продолжительность жизни больных с неполностью операбельным раком (от 9 до 17 месяцев) . Описанные примеры эффективного использования агонистов TLR в терапии опухолей показывают перспективность использования этих препаратов, а также целесообразность дальнейших исследований, направленных на создание противоопухолевых препаратов с аналогичным механизмом действия.

Однако, как сказано ранее в этом обзоре, большое количество опухолевых клеток могут экспрессировать ТLR на своей поверхности, и прямое взаимодействие таких клеток с лигандами к TLR может усиливать прогрессию опухоли, а также делать ее менее чувствительной к химиотерапевтическим препаратам. Таким образом, существует вероятность того, что постоянно циркулирующие в организме агонисты TLR (патогенные микроорганизмы, способные преодолевать иммунный барьер; ЛПС бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры кишечника, который может забрасываться в кровоток; собственные эндогенные лиганды) могут прямо или опосредованно способствовать усилению опухолевой прогрессии.

В связи с этим перспективное направление в терапии злокачественных новообразований состоит в использовании подходов, ориентированных на подавление TLR-зависимых сигнальных путей. В качестве уже известных подходов, применяемых в терапии злокачественных новообразований, можно выделить использование ингибиторов NF-kB.

Как известно, конститутивная активация этого фактора наблюдается в таких типах опухолей, как: болезнь Ходжкина, острый лимфобластозный лейкоз, множественная миелома, рак молочной железы, толстой кишки, легкого, яичников, предстательной железы, различные виды лимфом, рак печени, меланома и др. .

Для подавления активности NF-kB используются несколько групп лекарственных средств: нестероидные противовоспалительные средства, ингибирующие активность 1КК и СОХ-2; природные и биодоступные ингибиторы 1ККв - флавониды, про-стагландины, BMS-345541, PS1145, SС-514 и SPС839; а также ингибиторы протеасом, подавляющие активность NF-kB за счет предотвращения деградации 1кВ - бортезомиб (PS-341), иринотекан, гемцитабин и др. препараты, широко используемые в терапии опухолей толстого и тонкого кишечника, желудка, поджелудочной железы и др.

Поскольку фактор NF-kB является ключевым звеном TLR-зависимого сигнального пути, то использование его ингибиторов представляется перспективным для подавления TLR-зависимой стимуляции опухолевого роста.

Другой перспективной мишенью, по нашему мнению, могут быть сами TLR. Поскольку TLR2 и TLR4 (рецепторы, участвующие в стимуляции опухолевого роста) экспрессируются на поверхности клетки, представляется возможным использовать специфические молекулы (антитела, химические ингибиторы), подавляющие их функциональную активность. К настоящему моменту получены антитела, блокирующие активность TLR, однако данные по их клиническому использованию в доступной научной литературе отсутствуют.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ТLR входят в состав семейства PRR. Эффекты, связанные с их активацией, выходят за рамки реакций врожденного иммунного ответа. Участие в активации дендритных клеток, регуляции специфических иммунных реакций на уровне Т- и В-клеток, повышение экспрессии IFN и др. обусловливают вовлечение ТLR в формирование эффективного ответа врожденной и адаптивной иммунной системы при попадании в организм различных патогенов или при поддержании тканевого гомеостаза. Опубликованы результаты многочисленных исследований, согласно которым лиганды к TLR могут использоваться в качестве адъювантов для иммунотерапии злокачественных новообразований. Однако известно, что активация ТLR на поверхности опухолевых клеток может приводить к усилению прогрессии опухолей различного происхождения.

Такое различие в эффектах зависит, в первую очередь, от типа используемого лиганда. Как показано в табл. 1, ТLR можно разделить на две группы: индуцирующие и неиндуцирующие выработку Как правило, при введении агонистов TLR3, 4,

7, 8, 9, активирующих IRF, наблюдается подавление роста опухоли. В то же время данные о противоопу-

холевом действии агонистов TLR2, который в отличие от перечисленных рецепторов (TLR3, 4, 7, 8, 9) не способен активировать выработку IFN I типа, в настоящее время отсутствуют. Еще одна характерная особенность, обусловливающая различия в действии агонистов TLR на опухоль, - это способ их введения. Внутриопухолевое введение лигандов TLR3, 4, 7, 8, 9 в подавляющем большинстве случаев вызывает гибель клеток опухоли и уменьшение ее размеров. Наиболее вероятное объяснение противоопухолевой активности этих TLR заключается в их способности в ответ на взаимодействие с лигандом: а) индуцировать локальную экспрессию IFN типа I и II, которые, как известно, способны вызывать гибель опухолевых клеток; б) активировать клеточный иммунитет. При этом гибель опухолевых клеток, их фагоцитоз и последующая презентация опухолеспецифических антигенов обусловливают дополнительную стимуляцию специфического противоопухолевого иммунитета. Однако в ряде работ показано, что системное введение лигандов к TLR4 наоборот часто ассоциировано со стимуляцией роста опухоли. По нашему мнению, такое различие связано с тем, что вну-триопухолевые инъекции лиганда TLR4 (ЛПС) вызывают существенно большее накопление IFN непосредственно в опухолях, чем при системном введении лиганда. Поскольку IFN это короткодистантные эффекторные белки, действующие при достаточно высоких концентрациях, то их выработка вне опухоли (при системном введении) не приводит к гибели опухолевых клеток, а следовательно, и к развитию противоопухолевого иммунитета. При этом индуцируемые после локального или системного введения ЛПС провоспалительные цитокины и хемокины могут играть двойную роль: при внутриопухолевом введении ЛПС способствовать развитию противоопухолевого иммунитета, а при системном - в отсутствие мишеней для иммунной системы - положительно влиять на рост опухоли, устойчивость ее клеток и их метастатический потенциал.

Таким образом, имеющиеся данные указывают на двойственный эффект агонистов TLR на рост опухоли. Такое двоякое влияние ТLR говорит о более сложной функциональной роли TLR в биологии опухоли. Понятно, что подобная роль TLR выходит за рамки простой активации фактора NF-kB. Изучать влияние различных лигандов TLR на опухоль необходимо с учетом многих факторов, включая уровень экспрессии TLR; тип ткани, из которой происходит опухоль; микроокружение опухоли и многие другие. Системное исследование функций и роли ТLR на клетках опухоли может внести существенный вклад в разработку новых противоопухолевых средств с TLR-зависимым механизмом действия.

CnMCOK .HMTEPATYPH

1. Coussens L.M., Werb Z. // Nature. 2002. V. 420(6917). P. 860-867.

2. Mantovani A., Allavena P., Sica A., Balkwill F. // Nature. 2008. V. 454(7203). P. 436-444.

3. Okamoto T. // Endocr. Metab. Immune Disord. Drug. Targets.

2006. V. 6(4). P. 359-372

4. Thomas H.G., Han J.H., Balentien E., et al. // Methods Enzy-mol. 1991. V. 198. P. 373-383.

5. Kleeff J., Kusama T., Rossi D.L. // Int. J. Cancer. 1999. V. 81.

6. Deveraux Q.L., Schendel S.L., Reed J.C. // Cardiol. Clin. 2001.

V. 19(1). P. 57-74.

7. Dong Z., Wang J.Z., Yu F., Venkatachalam M.A. // Am. J. Pathol. 2003. V. 163(2). P. 663-671.

8. Bartsch H., Nair J. // Langenbecks Arch. Surg. 2006.

V. 391(5). P. 499-510.

9. Moser B., Willimann K. // Ann. Rheum. Dis. 2004. V. 63 Suppl 2. P. 84-89.

10. Rasmussen S.B., Reinert L.S., Paludan S.R. // APMIS. 2009. V. 117(5-6). P. 323-337.

11. Palm N.W., Medzhitov R. // Immunol. Rev. 2009. V. 227(1).

12. Zeromski J., Mozer-Lisewska I., Kaczmarek M. // Cancer Microenviron. 2008. V. 1(1). P 37-42.

13. Jego G., Bataille R., Geffroy-Luseau A., et al. //

Leukemia. 2006. V. 20(6). P 1130-1137.

14. Seya T., Akazawa T., Uehori J., et al. // Anticancer Res.

2003. V. 23(6a). P. 4369-4376.

15. Grauer O.M., Molling J.W., Bennink E., et al. // J. Immunol. 2008. V. 15. P. 6720-6729.

16. Medzhitov R. // Nat. Rev. Immunol. 2001. V. 1(2). P 135-145.

17. Pasare C., Medzhitov R. // Nature. 2005. V. 438(7066).

18. Zasloff M. // Nature. 2002. V. 415(6870). P. 389-395.

19. Doyle S.E., O‘Connell R.M., Miranda G.A., et al. // J. Exp. Med. 2004. V. 5. P. 81-90.

20. Werling D., Hope J.C., Howard C.J., Jungi T.W. // Immunology. 2004. V. 111(1). P 41-52.

21. Nijhuis M.M., Pasterkamp G., Sluis N.I., et al. // J. Vasc. Res. 2007. V. 44(3). P 214-222.

22. Kaisho T., Akira S. // J. Allergy Clin. Immunol. 2006.

V. 117(5). P 979-988.

23. Salaun B., Romero P, Lebecque S. // Eur. J. Immunol. 2007. V. 37(12). P. 3311-3318.

24. Iwasaki A., Medzhitov R. // Nat. Immunol. 2004. V. 5(10).

25. Pasare C., Medzhitov R. // Adv. Exp. Med. Biol. 2005. V. 560.

26. Li M., Zhou Y., Feng G., Su S.B. // Curr. Mol. Med. 2009. V. 9(3).

27. Curtiss L.K., Tobias P.S. // J. Lipid. Res. 2009. V. 50 Suppl.

28. Krieg A.M. // J. Clin. Invest. 2007. V. 117. P. 1184-1194.

29. Chicoine M.R., Zahner M., Won E.K. // Neurosurgery. 2007.

V. 60. P. 372-381.

30. Harmey J.H., Bucana C.D., Lu W. // Int. J. Cancer. 2002.

V. 101. P. 415-422.

31. Huang B., Zhao J., Shen S. // Cancer. Res. 2007. V. 67.

32. Means T.K., Golenbock D.T., Fenton M.J. // Life Sci. 2000. V. 8. P. 241-258.

33. Diebold S.S. // Handb. Exp. Pharmacol. 2009. V. 188. P. 3-30.

34. West A.P., Koblansky A.A., Ghosh S.// Annu Rev. Cell. Dev. Biol.

2006. V. 22. P. 409-437.

35. Zhang Z., Schluesener H.J. // Cell Mol. Life Sci. 2006. V. 63(24).

36. O‘Neill L.A., Bowie A.G. // Nat. Rev. Immunol. 2007. V. 7(5).

37. Stockfleth E., Trefzer U., Garcia-Bartels C. // Br. J. Dermatol. 2003. V. 149 (Suppl. 66). P 53-56.

38. Nogueras S., Merino A., Ojeda R. // Heart. Circ. Physiol.

2008. V. 294. P 708-713.

39. Okamoto M., Oshikawa T., Tano T., et al. // J. Immunother.

2006. V. 29. P. 78-86.

40. D‘Agostini C., Pica F., Febbraro G., et al. // Int.

Immunopharmacol. 2005. V. 5(7-8). P. 1205-1212.

41. Morales A., Eidinger D., Bruce A.W. // J. Urol. 1976. V. 116.

42. Street S.E., Cretney E., Smyth M.J. // Blood. 2001. V. 1; 97(1).

43. Swann J.B., Hayakawa Y., Zerafa N., et al. // J. Immunol. 2007.

V. 15;178(12). P. 7540-7549.

45. Balkwill F., Coussens L.M. // Nature. 2004. V. 431. P. 405-406.

46. Robak P, Smolewski P., Robak T. // Leuk. Lymphoma. 2008. V. 49. P 1452-1462.

47. Pikarsky E., Porat R.M., Stein I., et al. // Nature. 2004. V. 431. P. 461-466.

48. Palayoor S.T., Youmell M.Y., Calderwood S.K., et al. // Oncogene. 1999. V. 18. P 7389-7394.

49. Griffin J.D. // Blood. 2001. V. 98. P. 2291.

50. Philip M., Rowley D.A., Schreiber H. // Semin. Cancer Biol.

2004. V. 14. P 433-439.

51. Swann J.B., Vesely M.D., Silva A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 652-656.

52. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Зубкова О.В. и др. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2008. № 4. С. 6-9.

53. Logunov D., Scheblyakov D., Zubkova O., et al. // Oncogene. 2008. V. 27. P. 4521-4531.

54. Kim S., Takahashi H., Lin W.W., et al. // Nature. 2009. V. 457. P. 102-106.

55. Luo J.L., Maeda S., Hsu L.C., et al. // Cancer Cell. 2004. V. 6.

56. Huang B., Zhao J., Li H. // Cancer Res. 2005. V. 65. P 50095014.

57. Kim W.Y., Lee J.W., Choi J.J., et al. // Int. J. Gynecol. Cancer. 2008. V. 18. P 300-305.

58. Droemann D., Albrecht D., Gerdes J., et al. // Respir. Res.

2005. V. 6. P. 1-6.

59. Ilvesaro J.M., Merrell M.A., Swain T.M., et al. // Prostate.

2007. V. 67. P. 774-781.

60. Lotze M.T., Zeh H.J., Rubartelli A., et al. // Immunol. Rev.

2007. V. 220. P. 60-81.

61. Ellerman J.E., Brown C.K., Vera M., et al. // Clin. Cancer Res.

2008. V. 13. P. 2836-2848.

62. Cabezon T., Celis J.E., Skibshoj I., et al. // Int. J. Cancer. 2007. V. 121. P. 1433-1444

63. Adams S., O‘Neill D.W., Nonaka D., et al. // J. Immunol. 2008. V. 181. P. 776-784.

64. Spaner D.E., Miller R.L., Mena J., et al. // Leuk. Lymphoma. 2005. V. 46. P. 935-939.

65. Dudek A.Z., Yunis C., Harrison L.I., et al. // Clin. Cancer Res.

2007. V. 13. P. 7119-7125.

66. Schmidt J., Welsch T., Jäger D., et al. // Br. J. Cancer. 2007.

V. 97. P. 598-604.

67. Karin M., Yamamoto Y., Wang Q.M. // Nat. Rev. Drug. 2004. V. 3. P 17-26.

Уже упоминавшиеся Toll-рецепторы были открыты в совершенно ином, не иммунологическом контексте, в конце 1980-х годов.

Первый белок этого семейства был охарактеризован в лаборатории К. Нюсляйн-Фольхард (С. Ntisslcin-Volhard) в ходе скрининга мутаций в генах, участвующих в регуляции дорзовентрального компонента эмбриогенеза (10). Было обнаружено несколько генов, продукты которых принадлежали к одному и тому же сигнальному пути, причем одна из мутаций приводила к тому, что у личинок дрозофилы не было выраженной брюшной или задней стороны, весь эмбрион состоял как бы только из спины. Этот мутант и получил название “Toll”, что по-немецки означает «удивительно, необыкновенно», - именно из-за необычности фенотипа. По традиции генетиков, такое же название получил и ген. Интересно, что за комплекс работ, открывших большинство генетических путей, участвующих в раннем эмбриональном развитии дрозофилы (в том числе и за Toll), была присуждена Нобелевская премия 1995 г. — буквально накануне открытия роли этого гена во врожденном иммунитете. Возможно, Toll — самый «нобелевский» ген в истории науки.

Итак, ген Toll кодирует белок, состоящий из трех доменов, один из которых является трансмембранным. Внеклеточный домен содержит около 30 повторов с фиксированным расстоянием между консервативными лейцинами, их называют лейцин-богатыми участками или повторами (leucine-rich regions, LRR), и они встречаются во многих белках, связанных с иммунным ответом у разных организмов. Функция внутриклеточного домена первоначально была непонятна, но постепенно выяснилось, что она передаст сигнал на активацию транскрипционных факторов, которые являются мушиными родственниками NFkB. И у человека, и у мыши NFkB — это семейство чрезвычайно важных транскрипционных факторов, которые участвуют в индукции многих генов, вовлеченных в воспалительный и иммунный ответ. Как уже упоминалось, основным компонентом защитного ответа у мух является индукция антимикробных пептидов, которые, связываясь с клеточными стенками бактерий или грибков, убивают их. Когда в начале 1990-х годов были клонированы гены, кодирующие эти антимикробные пептиды, то выяснилось, что в их промоторах есть ДНК-последовательности, соответствующие NFKB-связывающим участкам. Это указывало на то, что гены, которые индуцируются в ходе защитного иммунного ответа по Toll-сигнальному пути, транскрипционно регулируются NFkB. Оставалось проверить, будут ли производиться эти защитные пептиды у мух, мутантных по Toll (исходная Toll-мутация не подходила, так как была летальной!), и что будет, если их инфицировать бактериями или грибками. Как отмечалось во введении, именно этот «нобелевский» эксперимент и был поставлен в лаборатории Ж. Хоффмана в Страсбурге Б. Лёметром. Оказалось, что мутантные мухи быстро умирали в ответ на грибковые инфекции именно из-за того, что антигрибковые пептиды, которые в норме быстро индуцируются в ответ на инфекцию, у них не синтезировались. Интересно, что ответ на некоторые бактериальные патогены у таких мух был совершенно нормальным, что свидетельствовало в пользу того, что мутация нарушила только одну из ветвей врожденного иммунного ответа.

Как уже отмечалось, спустя короткое время рецепторы, похожие на Toll, были проклонированы и у млекопитающих — у человека и мыши. Они получили название TLR — Toll-like receptors (или Toll — подобные рецепторы). Позднее выяснилось, что таких рецепторов у млекопитающих 10-12, причем количество функциональных рецепторов различается у разных видов, что указывает на недавние эволюционные изменения.

TLR мыши и человека также индуцируют сигнальный путь, приводящий к активации NFkB, что запускает экспрессию всевозможных эффекторных генов, включая гены воспалительных цитокинов и так называемых ко-стимуляторных молекул.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Клеточный толл-подобный рецептор 9 (toll-like receptor 9 , TLR9) - один из представителей «первой линии» иммунного ответа организма - специфично связывает вирусные и бактериальные ДНК, образуя характерные m-образные димерные структуры. Взаимодействие с патогенной ДНК происходит благодаря наличию в ней особой составляющей - цитозин-фосфат-гуанин (CpG) динуклеотидного мотива, который избирательно связывается с рецептором в определенных сайтах. Установление кристаллической структуры комплекса «рецептор-мотив» помогло лучше разобраться в особенностях работы этой составляющей врожденного иммунитета.

Подробное исследование особенностей связывания СpG-мотива с рецептором показало, что иммуностимулирующая активность динуклеотида зависит от нескольких важных факторов.

Первым и самым очевидным из них является количество неметилированных последовательностей цитозин-гуанин во «враждебной» ДНК. Чем больше СpG-мотивов присутствует в нуклеотидной цепи бактерии, тем большее количество рецепторов будет ее связывать.

Второй особенностью, которую удалось выявить, является определенный «шаблон» мотива, выражаемый формулой RRCG YY (где С - цитозин, G - гуанин, а R и Y - любые пуриновые и пиримидиновые основания соответственно). Примечательно, что инверсия C и G приводит к образованию только неактивного мономерного комплекса TLR9-СpG, в то время как формирование активного подразумевает димерную m-образную структуру с соотношением рецептор:лиганд равным 2:2 .

Третьим фактором выступает процессинг рецептора, который необходим для образования стехиометрического димера. Если процессинга не было либо он проходил неверно, образовывались практически лишь мономерные формы. Несвязанный димер TLR9 представляет собой так называемую Z-петлю, состоящую из участков, богатых лейцином (leucine-rich repeat, LRR ) (рис. 1).

Механизм связывания СpG-мотива с сайтом рецептора авторы исследования красноречиво окрестили «молекулярным клеем » . Фрагмент одноцепочечной ДНК обвивается вокруг рецептора, начиная с N-конца белковой молекулы и охватывая несколько LRR-сайтов. Именно одна нуклеотидная цепь может плотно облегать необходимые участки TLR9: при попытках использования в экспериментах двухцепочечной ДНК аффинитет рецептора резко снижался.

Сам СpG-мотив, согласно вышеуказанному шаблону представленный в виде гексамера, образовывал сложную систему водородных связей с двумя десятками аминокислот и дополнительно координировался Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями еще с десятком остатков. Важно, что подобной «атаке с флангов» подвергаются две молекулы ДНК, поскольку связанный комплекс рецептора существует в виде гомодимера (рис. 2). Несмотря на обилие аминокислот, связывающих СpG-мотив, мутации некоторых из них даже по отдельности могут серьезно понизить «налипание» динуклеотида на рецептор .

Чем может быть полезно такое глубинное выявление особенностей работы TLR9? Конечно же, созданием таргетных препаратов для стимуляции или, наоборот, ингибирования активности этих рецепторов. Нарушения в работе иммунной системы (как в сторону активации, так и супрессии) лежат в основе множества инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Знание структуры и механизмов работы участников врожденного иммунитета, несомненно, позволит проводить их регуляцию и возвращать «сбившиеся» параметры в норму.